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病原微生物检验实习总结 大三下学期5月份，我们动物检疫专业的同学开始了为期2个多月的教学实习，在众多辅导老师之中，我有幸跟随我校动物科技学院预防系的赵宇军教授进行学习。实习的地点就在我校动科楼的微生物实验室，以前我们曾在这里上过实验课，所以并不陌生。这次大家来到实验室为自行选择课题进行相关实验操作，我对世界闻名的金黄色葡萄球菌非常感兴趣，在老师的带领下进行了相关食物中该菌的检验。下面我们来回顾这次实验。 一、实验内容：食品中金黄葡萄球菌的检测方法 金黄色葡萄球菌是一种引起人类和动物化脓感染的重要致病菌，也是造成人类食物中毒的常见致病菌之一。本菌广泛分布于自然界，如空气、土壤、水及其它环境中。在人类和动物的皮肤及外界相通的腔道中，也经常有本菌存在。据报导，在正常人群中的带菌率可达30%~80%，其中皮肤带菌率为8~22%，鼻腔和咽喉部等上呼吸道的带菌率在40~50%以上，因此其可通过各种途径和方式，尤其是经工作人员的手和上呼吸道而污染食品。由于致病金黄葡萄球菌能产生肠毒素，故一旦细菌污染食品，并在合适的温度环境下，细菌可以大量繁殖并产生肠毒素，从而引起消费者食物中毒。 由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒，在世界各国都极为普遍。特别是在北美及欧洲等地区发病率更高。在上述这些国家中，每年有金黄色葡萄球菌引起的食物中毒病例，仅次于沙门氏菌，而在细菌性食物中毒病例排到第2~3位，有此而造成的经济损失也相当惨重，在我国由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒病例也时有报导，所以目前世界各国都把金黄色葡萄球菌列为食品卫生的法定检测项目。 我国对金黄色葡萄球菌目前采用的方法是以国家标准GB.4789-10-84及检验检疫系统行业标准SN.0172-92作为依据。整个检测过程获得最终结果须时5天左右，既费时又费力，并造成货物积压，也影响货物的及时出运，并使货主的仓储成本提高，造成较大的经济损失。 多年来很多食品微生物实验室都在探索和寻找一些准确性高，并快速的检测方法，最近我们分别从美国3M公司和法国生物梅里埃公司获得两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌的培养基，其名称为： ① Petrifilm RSA. Count Plate（由美国3M公司研制生产），是一种薄膜型快速检测金黄色葡萄球菌的计数平板。 ② Baird-parker + RPF Agar.（由法国生物梅里埃公司研制生产的用Baird-Parker琼脂加免血浆纤维蛋白原的金黄色葡萄球菌检测计数平板）。 原理： Petrifilm. RSA. 测试薄膜是由二部分组成。第一部分是由黄金色葡萄球菌培养基片，此培养基中含有经修正的Barid-Parker，营养成分加上以冷水可溶解的胶质。第二部分是一种耐热核酸酶（TNase）反应片，含有DNA及甲苯胺兰 ( Toluidine Blue - O )及四唑指示剂 (Tetraeolium)。此指示剂有助于菌落的计数及确定葡萄球菌耐热核酸酶的存在。 耐热去氧核糖核酸（deoxyribonulcas Dnase）为产毒金葡菌之典型特征，此酶非常耐热，在100℃加热30min，不易丧失活性，在130℃之下，其D值为16.6min，此酶之分子量为16800，等电点PH为9.6,耐热去氧核糖酸与检测血浆凝固酶相似，是一种鉴定金黄色葡萄球菌的方法，在Petrifilm. RSA 检测片上，耐热DNA酶反应看起来，呈粉红色环带包围着一个红色或兰色的菌落。 Petrifilm.RSA检测片，必须与Peyrifilm耐热核酸酶反应片一起使用，单独使用将不会显示菌落，因为具有辅助计数菌落的指示剂是在反应片上，而不是在Petrifilm.RSA检测片上。 Baird-parker + RPF agar，这一培养基中含有丰富的营养成分，其中以氯化锂代替亚碲酸钾，使菌落颜色呈黑色，RPF补充有兔血浆和牛纤维蛋白原，以便检测凝固酶活力，胰酶可以抑制全部或部分围绕凝固酶阳性菌落周围沉淀晕环纤维蛋白的溶解，因此凡存在血浆凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌，将在培养基中呈现有晕环的黑色菌落，即可确认，并作计数。 实验 材料和方法： 本次实验采用以下3种试剂： 1. 美国3M公司提供的Petrifilm. Rapid. S. aureus Count Plate. 2. 法国生物~梅里埃公司提供的Baird-Parker + RPF agar . 3. 实验室自配Baird-Park琼脂（英国Oxoid）及新鲜兔血浆。 菌种来自美国菌种保存中心（America TyP Culture Collection）。金黄色葡萄球菌共10株菌株，其菌号分别为： ATCC 27661 ATCC 27664 ATCC 13565 ATCC 51704