付瑞玲毕业答辩.pptVIP

Table1 Primer list and thermal cycle parameters for cloning of M.tuberculosis recombinant antigens Antigen Primer orientation and sequence （5‘-3’） PCR parameters Amplicon size 试验方法的确立 硕士研究生： 付瑞玲  导 师： 范雄林 副教授 华中科技大学同济医学院病原微生物学系 结核杆菌特异抗原CFP21和MPT64 融合蛋白的重组表达、纯化及其免疫原性 研究背景 Estimated TB incidence rates, WHO 2004 0 - 24 25 - 49 50 - 99 100 - 299 No estimate 300 or more Estimated new TB cases (all forms) per 100 000 population 结核病(TB)是经呼吸道传播的、严重危 害全球人类健康的重大公共卫生问题 全球感染者占总人口的1/3； 我国感染人数5.5亿； 感染者发展为结核病的可能性为5-10%； 缺乏特异的诊断方法； 缺乏有效的疫苗 我国和全球结核杆菌感染者 3. 值 潜伏感染者的筛检和预防措施 筛检方法： 非特异性——TST的活性成份是纯蛋白衍生物(PPD)，一种结核分枝杆菌非特异的混合物,其检测结果可被目前临床上广泛使用的疫苗——卡介苗免疫所干扰。 较特异性—— 更特异性——无 预防疫苗：无 研究目的 1 建立更加特异 2 寻找发展感染清除疫苗的适宜靶抗原 3. 值 结核杆菌特异抗原的选择 M. bovis M. tuberculosis BCG substrains（1921-1931） M. bovis M. tuberculosis M. Kansasii M.marinum M. leprae M. szulgai RD2区 RD1区 保护性抗原如CFP21、MPT64，分别能够刺激强 的迟发型变态反应和诱导结核病人和他们的接触者的外周血产生高水平的干扰素 重组表达CFP21和MPT64的融合蛋白，建立了全血IFN-γ水平分析技术(rCM-WBIA)， 检 测LTBI的 以及评估该蛋白作为感染清除疫苗靶抗原的可能性 CFP21和MPT64蛋白 研 究 人 群 年龄范围（岁） 受试者（人） 男女比例 结核病患者 38±10 10 4：6 密切接触者 35±18 36 16：20 TST-对照 20±3 40 22﹕18 注:所有参与者均为自愿。 实验流程 IPTG诱导 受试者 TST- TST＋ rCM-TST- rCM-TST+ rCM+TST- rCM+TST+ rCM+TST++ 2.SDSWestern blot 1.构建原核表达质粒 3.纯化rCM 4.建立 rCM-WBIA TST 健康者 密切接触者 研究结果 CFP21 F A A G G A T C C G A T C C G T G T T C G G A C A T C G C G G T C G R:GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCTCCGGCGTGATCGAGCCTGTTCGCC 94℃ for 5 min Then 30 cycles 94℃ for 1 min 60℃ for 1 min 72℃ for 45 s Then 72℃ for 5 min 608 bp Mpt64 F:GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGT GGCGGCAGCGCGCCCAAGACCTACTGCGAGGAG R:GAAAGCTTCTAGGCCAGCATCGAGTCGATCGC 94℃ for 5 min Then 30 cycles 94℃ for 1 min 60℃ for 1 min 72℃ for 45 s Then 72℃ for 5 min 671 bp rCMF CFP21F rCMR MPT64R 94℃ for 5 min Then 30 cycles 94℃ for 1 min 60℃ for 1 m