构建载体基本步骤.docVIP

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构建载体基本步骤.doc

载体构建流程 基因的获得 已获得基因 RT-PCR 回收 A. 酶切回收:一般做50-100ul 体系,然后跑电泳回收,回收量一般为30ul。 B. PCR回收:一般做总体系为100-200ul的PCR量(用高保真酶:如PFU酶、KOD PLUS酶),分成约50ul/管,然后上PCR仪。 跑电泳回收,约30ul。 酶切回收,做100ul体系, 直接过回收柱回收DNA片段。 连接 连接体系总量一般为10-20ul。12℃-16℃ 过夜。 转化 一般转化DH5α感受态,10-15ul 连接液转化到50ul感受态中。 冰浴1h 热休克42℃ 90 秒 冰浴5分钟 加200ul LB液,37℃ 振摇1 h 铺相应抗性的平板。置37℃孵箱,培养12h. 挑克隆 从平板上挑取数个克隆,于相应抗性的LB中,37℃培养12h. 抽提质粒 手工抽提质粒,一般溶于30ulTE或EB。 鉴定 酶切鉴定 :一般用什么酶装上的,就用什么酶鉴定。但原则是选用相对便 宜的酶 。 选择原来载体上没有而基因上有的酶切位点与载体上另一酶切位 点共同鉴定。 一般鉴定选择2-4组酶,来确定构建的载体是否正确。 B.PCR鉴定:一般扩增目的条带。也可扩增载体和目的条带连接处的片段。 酶切回收 PCR回收 PCR

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