分子克隆载体.ppt

lF1、3 met-GTP-lF2 30S 50S GDP+Pi lF2, fmet fmet 30S 50S lF1、3 mRNA GTP 基因克隆时的定向插入 插入序列两边的酶切口不同,插入的组件不会倒装，保证了在其下游目的基因插入后，沿5’→3’方向正确转录，这种构建方式称为定向插入。 EcoRI HindIII Ori复制起点 LacZ APR pUC19 如果插入序列自身不含ATG起始密码,或限制酶切点不能把读码框准确置于ATG之后,或插入片段编码未清楚,可在目的基因之前设保险序列: 5’…ATGNATGNATG 5’…ATGNATGN ATG 123 456 5’…ATGN ATG NAT GXY 123 456 5’…ATG NAT GNA TGZ 123 456 能正确读出三联体密码的起始序列 TAA ATG I II III IV V I V I II V ATG I II III V I II III Ori 转录起始 翻译起始 信号肽 成熟蛋白质 转录终止区 CS CS CS CS--cloning site 质粒(plasmid ) ?Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。 ? ? Plasmid chromosome ? ? 基因载体应具备的条件： （1）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1个； （2）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验； （3）有一定容量； （4）有相当的抄本数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。 多克隆位点 ori 复制起始点 遗传标记 Amp polylinker 基因载体 1、质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。 2、编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。 3、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制。 4、质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。 质粒的生物学特性 5、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。 6、质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。 ?第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。 第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。 发展概况 pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。 许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。可见其原型质粒在使用上有优点。 pBR322 有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个，几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件。 此外，pBR322DNA，被限制性内切酶消化后产生的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的分子质量标准。 普通型载体pBR322的结构图 抗药性标志的选择 pBR322 Amp Tet 插入片段 Amp平板 Tet平板 pUC质粒系列 pUC质粒系列也是在pBR322基础上改建成的。 它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和复制起始点。去除了pBR322的tetr区段，换用了M13