色谱柱的再生.doc

色谱柱的再生 色谱柱的再生，这大概是一种美好的愿望，但是对于我们这种经费少的单位，只能死马当活马医治，所以再生的手段是必不可少的。再生要根据色谱柱的具体类型来选择再生方式，当然，前面也说过了，再生这个词用在这里是不太恰当的。那么什么问题会导致我们要对色谱柱进行再生呢？通常，样品中含有一些对分析者来说不感兴趣的东西。盐、脂质、含脂物质、腐质酸、疏水蛋白质和其它一些生物物质是一些可能在使用时与HPLC柱发生相互作用的物质。这些物质有比分析者的目标物或少或大的保留值。那些保留值较小的物质如盐类一般来说在空体积时就被冲出色谱柱。这些非目标产物的干扰能被检测器检测到而且能形成色谱峰，气泡，基线上移或者是负峰。如果样品成分在柱子中有很强的保留而且流动相溶液成分不足以把这些物质洗脱下来，多次上样后，这些吸附在柱子表面的物质通常就会积累在柱头。这些行为通常只有通过平行实验才能发现。有着中等保留值的样品能被缓慢洗出而且表现为宽峰，基线扰动，或者基线漂移。有时候这些被吸附的样品成分累积到一定程度足以使他们开始形成新的固定相。分析物能与这些杂质作用形成一定的分离机理。保留时间会波动，拖尾会出现。如果足够的污染产生，柱子的反压能超过泵所能承受的最大压力，使柱子无法工作以及在堵塞处产生空体积。这时，我们就要对色谱柱进行再生，有的时候是和清洗混到一起的。再生反相色谱柱1、首先倒转柱子。2、以大约最佳流速的40%的流速冲洗柱子大约45-60分钟，使用的溶剂的顺序要按照水—甲醇—异丙醇—二氯甲烷—异丙醇—甲醇—水进行。3、柱子转回正常方向，使用分析所用洗脱液平衡。注意：在使用另外的淋洗方法的时候，一定要先用水开始冲洗以去除缓冲液，保证其后的洗脱液可以混溶。详细见梯度洗脱需要注意到问题我也会另辟文章详细写一下流动相的互溶问题。再生硅胶柱1、首先倒转柱子。2、以大约最佳流速的40%的流速冲洗柱子大约45-60分钟，使用的溶剂的顺序要按照异辛烷（或己烷）—乙酸乙酯—干燥的异辛烷（或己烷）进行。3、柱子转回正常方向，使用分析所用洗脱液平衡。而对于再生极性键合柱，取决于使用的条件，可以使用反相的条件，也可以使用硅胶柱的条件。一定要注意到是：再生会导致柱效降低，另外绝对不要使用酮类或醛类冲洗氨基柱，因为可能与固定相发生反应。四氢呋喃作为替代可以使用。进行色谱柱再生时，我们建议最好不适用您的高效液相色谱仪上的泵。下表是建议用来冲洗的溶剂体积：请根据您的实际情况，选择正确的再生方法：1、极性固定相(如Si，NH2*、DIOL基色谱填料)的再生：正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**2、非极性固定相(如反相色谱填料RP-18，RP-8，CN等)的再生：水→乙腈→氯仿(或异丙醇)→乙腈→水3、0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱。注意：*在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。**如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。