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检验医学专业实验IV 临床生物化学检验部分.doc
自动生化分析仪实际K值测定
实际K值:理论K值受样品和试剂的加量准确度、比色杯光径准确度,尤其是ε的影响。ε在波长和温度等不同时有所不同,故有必要获得用户所用分析仪的实际ε,再计算K值,此为~。
一、340nm波长实际K值测定
【实验原理】:通过有NAD+(NADP+)参与的反应途径,用NADH或NADPH标准液来校正仪器。用己糖激酶(HK)方法测定葡萄糖时,葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯品,当反应达到终点时,NADH的摩尔数等于标准的葡萄糖摩尔数。在需要校正的仪器上测其A即可求得实际摩尔吸光系数,计算出实际K值。
【注意事项】
1.减少偶然误差 重复测定10次,当CV5%时,则重新测定10次。
2.减少系统误差 使用实际K值计算酶活性。
3.如果实际ε值与理论ε值偏差过大,需对仪器检修和校正。
二、405nm波长实际K值测定
【实验原理】:许多酶活性测定时,以人工“色素原”为底物,经酶作用后可释放出在405nm波长具有吸收峰有色的反应产物,如对硝基苯酚(4-NP)、对硝基苯胺(4-NA)、对硝基-5-氨基苯甲酸(ANBA)。他们在405nm波长时的理论ε分别为18 700、9 870、9 490。可使用其相应的纯标准品在需要校正的仪器上测其A即可求得实际ε,计算出实际K值。以ALP实验 (产物为4-NP) 为例测定实际K值。
【注意事项】
1.4-NP标准品纯度要求较高,必要时需纯化。
2.其他注意事项参见340nm K值校正。
三、如何校正K值
在理论K值或实际K值得情况下,测定某标准品的含量,若测得的结果偏低,则需要把测得的结果调整至原标准品的含量,此时调整的数值称为校正因子,则校正K值=理论(实际)K值 × 校正因子=理论(实际)K值 × 校准值 ÷ 实测值
NADH正负向反应测定酶活性
一、血清乳酸脱氢酶测定
LD催化反应式为:L-乳酸 + NAD+(LD)→ 丙酮酸 + NADH + H+
在反应过程中,乳酸被氧化生成丙酮酸,同时NAD+还原为NADH。因NADH在340nm处有吸收峰,反应会引起340nm吸光度的增高。吸光度增加的速率与样本中LD活性呈正比关系。NADH正向反应的最适pH偏碱性,可使反应平衡偏向产生丙酮酸的方向。
【参考范围】成人血清LD :109 U/L ~245 U/L
【临床意义】
1. LD活性增高:目前临床测定LD活性常用于心肌梗塞、肝病和恶性肿瘤的辅助诊断。
2. LD活性降低:目前没有发现重要的临床意义。
3. LD的特异性差,几乎存在各种组织中,如:心、肺、肾、肝、骨骼肌以及恶心肿瘤等疾患时均致此酶增高。
【注意事项】
1. LD活性测定可用抗凝血浆,肝素的影响不大, 而草酸盐抗凝剂、EDTA都是LD的竞争性抑制剂,能抑制LD活性。
2. 不同的LD同工酶对温度的敏感性有差异。组织提取液若放于-20℃过夜,LD4和LD5会丧失全部的 活性。
3. 严禁使用溶血标本,红细胞、血小板中含有大量的LD。
4. 比色应在5~15min内完成,否则吸光值会降低。
【评价】
LD能可逆地催化乳酸(lactate, L)和丙酮酸(pyruvate, P)之间的氧化还原反应。
1. 正向反应最适pH是8.8~9.8,能使平衡偏向生成丙酮酸的方向。
其优点是乳酸和NAD+稳定性好。且NAD+纯品价格较低,过量乳酸对LD活性的抑制较小,反应线性较宽,重复性较好,特异性高。
缺点是需要较高的底物浓度,反应速度较慢。
2. 逆向反应的最适pH为7.4~7.8,与生理性pH相同。
其显著的优点是NADH用量少,仅为正向反应的3%,且反应速度比正向快3倍,灵敏度高。
缺点是但丙酮酸与 NADH的稳定性较差,过量的丙酮酸对LD活性的抑制作用较大。
二、连续监测法测定血清ALT
【实验原理】
L-丙氨酸 + α-酮戊二酸 (ALT) → α-丙酮酸 + L-谷氨酸
α-丙酮酸 + NADH (LD)→ 乳酸 + NAD+
在340nm处连续监测到NADH的消耗量,从而计算出ALT活性浓度。
在双试剂测定中,首先使血清与缺少α-酮戊二酸的底物溶液混合,37℃保温5min,将样品中所含的α-酮酸(如丙酮酸)消耗完,然后加入α-酮戊二酸启动ALT催化的反应,在波长340nm处连续监测吸光度下降速率。
【参考范围】:成人血清ALT 5U/L~40U/L。
【临床意义】
1.ALT是肝细胞损伤的诊断指标
①急性肝细胞损伤的灵敏指标。②慢性活动性肝炎或脂肪肝时,转氨酶轻度增高(100U~200U),或在正常范围,且AST>ALT。③肝硬化、肝癌时,ALT有轻度或中度增高,提示可能并发肝细胞坏死,预后严重。④其它原因引起的肝脏损害,如心功能不全时,肝淤血导致肝小叶中央带细胞的萎缩或坏死,可使AL
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