通过宏基因组途径挖掘植物内生菌天然产物资源.pdfVIP

1986年获一项中国科学院科技进步一等奖，1996年获一项中国农业部科技进步三等奖； 发表研究论文46篇。 通过宏基因组途径挖掘植物内生菌天然产物资源 王浩鑫，沈月毛· 厦门大学生命科学学院细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室；厦门市海洋微生物新药工程技 术研究中心；福建省药物工程实验室，福建省厦门市思明南路422号，邮政编码：361005，电话： 0592—2184180，I争J0：0592—2181722，E--maih Z!照璺璺鱼!磐坠：曼曼坠：!垒。!!垒gb!Q!i垒鱼!堡坠：!垒坠：￡垒 植物内生菌中可培养的微生物种类十分有限，宏基因组学(metagenomics)是研究植 物内生菌的有效手段之一。美登木素是上世纪70年代最先从卫矛科植物美登木中发现，具 et 有很强抗肿瘤活性的ansamycin类化合物，属于I型聚酮(Kupchan，Komodaa1．1972)。 后来发现美登木素类化合物在卫矛科美登木属、大戟科蛇滑桃树属和鼠李科蛇藤属植物 et et (Cassady，Chana1．2004)以及某些苔藓(Sakai，Ichikawaa1．1988)和放线菌 et (Higashide，Asaia1．1977)中均有分布。鉴于美登木素的分布和化学结构特征，我们猜想 植物美登木素可能是内生微生物来源。本研究以滑桃树TrewianudifloraL．为实验材料，尝 试通过不依赖于纯培养的宏基因组学研究方法，构建滑桃树茎皮内生菌的宏基因组文库，并 从该文库中筛选获得滑桃树中美登木素类化合物的生物合成基因簇，为植物美登木素类化合 物的微生物起源提供直接证据。 植物内生菌宏基因组研究包括内生菌的富集，宏基因组DNA的提取，文库的构建与评 价，文库的筛选四个主要步骤。内生菌的富集是整个工作的基础。植物内生菌分布于植物组 织细胞间隙或内部，基因组与生物量相对植物来说非常微小，这给植物内生菌的富集带来了 很大困难，这可能是植物内生菌宏基因组研究至今未能广泛开展的主要原因。通过不断地摸 索与尝试，我们建立了一套行之有效的滑桃树茎皮内生菌富集方法，包括机械匀浆、低浓度 SDS／NaCl选择性沉淀与裂解和差速离心等。该方法可以一次性处理大量植物材料，快速简 便地富集植物内生菌，通过扫描电镜观察与基于16SrDNA的富集效果检测，表明该方法得 到的富集样品无明显的植物细胞器残留，内生菌多样性丰富，符合构建内生菌宏基因组文库 et 的要求(Wang，Genga1．2008)。 用上述方法，对1．6 菌酶对富集沉淀预处理，用蛋白酶K法提取DNA，所得DNA用UNIQ-10柱纯化、浓缩， DNA”。16S DNA” 得“metagenomicrDNA的ARDRA分析与测序结果表明：“metagenomic 中绝大多数为微生物来源，在187个16SrDNA克隆中只有4个来源于滑桃树叶绿体，其 余则来源于 AcIInobad呤ria．Proteobacteria．Gemmatimonadetes。Firmicutes。 Fosmid宏基因组文库，文库平均插入片段大小约为34．5kb， DNA”构建了CopyControl 全部感染后得到约177万个克隆，总插入片段约61Gb。通过对约200个随机Fosmid的 末端测序来评价文库质量，结果表明约88．8％的文库插入片段来源于原核生物，1．6％的插 et 入片段来源于真核生物，其余9．6％的插入片段来源无法判断(Wang．Genga1．2008)。 Ansamycins是一类主要由微生物产生结构较复杂的大环内酰胺类抗生素，这类化合物 以出色的生物活性吸引了研究者的兴趣。Ansamycins的合成以3．氨基．孓羟基苯甲酸 et (AHBA)为起始单元(A