非小细胞肺癌中miR181a5p功能研究.docVIP

miR-181a-5p在非小细胞肺癌中的功能研究 [摘 要] 目的 探索miR-181a-5p 的抑癌机制，并探讨它作为标志物用于检测肺癌细胞的可行性。方法：采用Methods 1.To examine the cell growth and apoptosis, CCK8 and flow cytometry were applied ,respectively. 2. To determine the expression effects of miR-181a-5p, western blot blot was used.3. Transwell assay and wound healing assay. 4. Plasmid constructs and luciferase reporter assay.Results 1. miR-181a-5p inhibited cell proliferation and promoted cell apoptosis in vitro.2. Transwell assay and wound healing assay showed that miR-181-5p negatively regulated cell migration in vitro.3. miR-181a-5p down-regulated Kras expression by directly targeting its 3′-UTR 5. Kras is inversely correlated with miR-181a-5p expression in NSCLC. Conclusion miR-181a-5p might provide a potential treatment approach for NSCLC patients. [Keywords] miR-181a-5p;Proliferation；migration;?apoptosis;?non small?cell lung cancer 恶性肿瘤为全球较大的公共卫生问题之一，给人类的身心健康带来了极大的危害，并将在新世纪成为威胁人类生命的第一大杀手1-2]。[3-4] 1 材料与方法 1.1 实验材料 非小细胞肺癌细胞株SPCA-1 购自ATCC；非小细胞肺癌细胞株A549 购自中科院生化细胞所细胞库。 1.3 实验方法 （1）细胞培养：非小细胞肺癌细胞株A549、SPCA-1分别培养在含有10%胎牛血清、青霉素105IU/L、链霉素100mg/L培养基于37，CO2体积分数为5的细胞培养箱内培养。细胞融合到85%左右时，用0.25%胰酶消化，传代9]。5]： 取对数生长期的细胞，以1×104个/mL的密度接种于96孔培养板中，每孔接种100μL，培养待细胞贴壁后，再分别加入每组设置6个复孔，同时设置不受处理因素的对照组也设置。分别培养24h和48h后，每孔加入25μL的MTT噻唑蓝，继续培养4h后小心弃去培养液，再每孔加入150μL的DMSO，于摇床上振摇10min充分溶解生成的结晶然后于490nm波长处测定各组的光吸收值（OD值），重复3次，取均值。用下面的公式计算各组药物的细胞的抑制率10-11]： 抑制率=(1-药物组OD值/对照组OD值)×100％[6] 按照流式细胞仪检测细胞凋亡试剂盒操作以适量的胰酶消化收集转染后的min收集5×105）个细胞，离心沉淀，加入500ulBinding Buffer重悬细胞向重悬液中加入PI染色室温下避光孵育min，流式细胞仪检测凋亡率实验重复7] 从A549细胞中提取总RNA，并反转成cDNA后用来作为PCR的模板，成功的得到了5种靶基因的目的片段。经割胶回收后，在37℃用相适应的限制性内切酶酶切2 h后，用T4 DNA连接酶16℃连接过夜后，转化TOP10大肠杆菌感受态细胞。挑取单克隆经扩大培养后，提取质粒，送至上海英俊生物公司测序。经序列比对无误后，用无内毒素质粒大抽试剂盒提取重组质粒。抽得重组质粒，用限制性内切酶酶切验证.。 （5）细胞运动实验 [8-9] 在显微镜载物台上静置细胞2.5h，通过摄像头、监控仪、录像机等设备记录真个过程，然后通过图像转化和采集系统保存实验照片。用Imagine Tool和mage-Pro Plus 6.0测量每个时间点内稀薄啊的几何中心二维坐标用icrosoft Excel 2013XY散点兔绘制细胞迁移轨迹时间间隔为 （5）qRT-PCR分析基因转染miR-181a-5p下调： 在 A549 细胞中做做转染，对照组转染 NC，实验组转染miR-181a-5p ，在 mRNA 水平检测 miR-181a-5p 对靶基因的