Hb的醋酸纤维薄膜电泳.pptVIP

正常成人Hb种类： 组成 百分含量 pI HbA α2β2 95~98% 6.95 HbA2 α2δ2 2~3% 7.38 HbF α2γ2 1% 6.95 醋酸纤维素薄膜是由纤维素的羧基进行乙酰化后而制成的，浸湿后有巨大的张力和柔韧性，几乎对所有生物活性物质均能通过电泳得到分离。 醋酸纤维素薄膜电泳因设备简单、操作方便、电泳时间短、分辨率高、区带分离清晰、无拖尾、易定量等，已成为临床、实验室首选的方法。 2.制备Hb液： 1）洗涤红细胞：将上述离心管，颠倒混匀5-6次，4000rpm，离心3分钟。弃上清，再加1ml 0.9%NaCl悬浮红细胞，相同条件重复离心一次。 2）溶血：向红细胞沉淀中加入蒸馏水1～ 2滴，摇匀，再加入四氯化碳1滴，振荡混匀，相同条件再离心一次，取上清即得Hb液。 血红蛋白病分类 1.异常Hb病： 基因突变导致珠蛋白结构改变.例如：镰状红细胞贫血. 形成原因： ?链第6位谷氨酸被缬氨酸取代，形成HbS（镰状Hb)取代了正常的Hb。在缺氧情况下，HbS聚合形成长棒状聚合物，使红细胞镰变,变形能力低，导致溶血、贫血，引起血粘度增高，血管梗阻性继发症状。 发病的分子基础是： β链基因的一个碱基对GAG变为GTG，致使血红蛋白的β链N端第6位的谷氨酸被缬氨酸取代形成HbS。 2.地中海贫血： 基因突变导致珠蛋白肽链合成缺乏或合成量异常，如α、β地贫。 血红蛋白醋酸纤维薄膜碱性电泳 实验四 电泳： 指带电胶体粒子或分子在电场的作用下，作定向移动。 由于各种物质分子的等电点不同在同一PＨ环境中所带的电荷各不相同,再由于分子量、分子结构、形状大小各有差异，因此在同一电场中泳动速度也就不一样。一般来说，所带的电荷多而分子量小、形状越接近球形者，泳动速度快，反之则慢。 电泳技术的分类：主要归纳为； 1）显微电泳——即在显微镜下观察胶体粒子或细胞的移动度，也称细胞电泳。 2）自由电泳——即悬浮在介质中的细胞和生物大分子，在电场作用下自由定向移动。 3）区域电泳（区带电泳）：即在不同电力条件、支持物上进行直接分离，鉴定生物物质，促使获得各自电荷差异的生物粒子或分子形成各自区域以帯形停留在载体上。如：滤纸、淀粉、琼脂、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等，此类 电泳技术分离技巧简便，运用十分广泛。 4）免疫电泳：即抗原与抗体在比例合适的琼脂糖载体中相结合的一种电免疫技术，亲和电泳即属此类。。 根据缓冲液的性质不同可分为： 1.连续系统：电泳缓冲液的离子成分、PH、电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应。 2.不连续系统：电泳缓冲液离子成分、pH、电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液不尽相同，带电颗粒电泳时具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。 血红蛋白（Hb) 的组成及分类： 血红蛋白（Hb)：由亚铁血红素、珠蛋白 组成 。每个珠蛋白分子由4条多肽链构成 ，根据其一级结构的不同可分为α、β、γ、δ四种类型。 实验原理(Experimental Principles) 在pH8.6的环境中，Hb是一种带负电荷的蛋白质（Hb的pI 〈 8.6），在电场中向正极泳动。电泳时，由于各种Hb等电点不同，所带电荷量不同；分子量大小、形状不同，导致各自的泳动速度不同，因而被分离。这种分离可初步鉴定不同的Hb。 。 实验材料、主要仪器和试剂（Equipments , Materials and Agents） 1、试剂 0.9%的NaCl溶液；蒸馏水； 四氯化碳；碘酊；75%酒精；TEB缓冲液（pH8.6）；丽春红染液；漂洗液。 2、实验器材 醋酸纤维薄膜；滤纸；电泳仪；一次性穿刺针；消毒棉签。 操作步骤（Operating Procedure） 1.取血： 用2%碘酊棉球消毒受试者手指，再用75%酒精棉球脱碘，采血针穿刺，取血约0.05ml放入事先已加入0.9%NaCl 1ml 的1.5ml离心管中。如出血不畅，可对手指稍加挤压。 3.电泳 1）膜条准备： 2）点样：取出平衡好的膜条，用滤纸吸去多余的液体，然后平铺,（毛面朝上），用小玻片沾取适量Hb液，按印于点样线上，点样处离膜条边缘1.5cm左右。 3）电泳