血清蛋白醋酸纤维.pptVIP

实验八 血清蛋白醋酸纤维 薄膜电泳 【实验目的】 1．熟悉蛋白质的两性性质。 2.了解电泳法分离蛋白质的原理及操作。 【实验原理】 在外加电场的影响下，带电的胶体粒子或离子在分散介质中作定向移动的现象称为电泳。在电泳过程中，带正电荷的离子向阴极移动，带负电荷的离子向阳极移动。移动速度与带电荷物质或离子的性质有关（如正、负电荷、电量和它本身的质量等）。 由于混合物中各组成成份所带电荷的性质、电荷的数量和物质分子量的不同，在相同条件和同一电场的影响下，各带电物质移动的方向和速度便不相同，带电多而分子量小的物质，其移动速度快，带电少而分子量大的物质，其移动速度慢。因此在一定时间内带电物质移动的距离也就各不相同，这样使混合物达到分离的目的。 电泳速度的大小，受一些因素的影响，如缓冲溶液、浓度，样品的性质和用量、滤纸的性质、点样的技术、电泳时放出的热量和空间的温度等因素影响，除上述因素影响外，主要影响因素还有：① 离子的迁移率；② 电渗；③ 电场强度；④ 试样的pH值。为克服上述的某些影响因素，本实验室采用醋酸纤维（二乙酸纤维素）薄膜为电泳支持物，其具有均匀沫状结构，渗透性强，对分子移动阻力小的特点。 根据蛋白质的两性性质，可以用电泳法将血清中不同的蛋白质分离。血清中含有数种基本的蛋白质成分（清蛋白和四种球蛋白等），其等电点在5～7之间，因此，在pH大于其等电点的缓冲溶液中，这些蛋白质分子均带多少不等的负电荷，电泳时，将血清点于醋酸纤维薄膜一端，并通过直流电，蛋白质分子因带负荷，故自负极向正极泳动。 在同一pH的缓冲溶液中，血清中各种蛋白质所带静电荷不同，分子量不同，因此它们在电场中的移动速度也各不相同，分子量较小而带电荷多者移动速度较快。分子量大而带电荷少者移动速度较慢。所以经过一定时间后可将血清蛋白分为五个区带，即血清蛋白和α1．α2．β、γ四种球蛋白。 【实验步骤】 1．仪器装置 将电泳仪输出极与电泳槽的白金丝电极相连，在电泳仪正、负极的贮液槽内各注入巴比妥缓冲液至槽容量的2/3以虹吸管调整两个贮液槽的液面高度相等。将四层滤纸分别紧帖在正、负极两边的隔板上作为盐桥。 2．点样 将已浸透巴比妥缓冲液的薄膜用镊子取出，并夹于滤纸上，轻轻吸去多余的缓冲液。用点样橡皮塞粘取少量血清，先将橡皮塞在一干净的滤纸上轻轻粘一下吸去过去的血清，然后在薄膜无光泽面的一端约1.5cm处（画有一横线）点样（应粗细均匀）。待血清渗入膜内后，将无光泽面向下紧贴于滤纸桥上（点样端靠近负极），罩上玻璃罩。 3．通电 将电泳仪与交流电源接通，电压为90V～120V，电流为0.4 mA/cm2～0.6mA/cm2，通电60min后关闭电源。 4．染色 将薄膜取下直接浸于染色液，5min～10min后取出。用漂洗液漂洗三次，脱色至背影无色为止。此时即可见到薄膜上有五条已染上颜色的蛋白质区带。离点样端最远的为清蛋白，以下顺序为α1、α2、β、γ四种球蛋白。 经上述电泳分离的血清蛋白的五种成分还可进一步根据颜色的深浅用比色法测出其相对含量。 注意事项 注意点样端放在负极上 2. 样品点在薄膜的毛面 思考题 1. 电泳的基本原理是什么？ 2. 缓冲溶液的作用是什么？ * *