高效液相色谱-1.ppt

高效液相色谱 (1)（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）——概述、理论与仪器 许 旭分析室色谱组  Tel: 3426 Email: xuxu@ 1. 绪论，基本概念 1.1 方法简介 以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法。 (包括纸色谱、薄层色谱法、柱色谱等) 高效液相色谱法是指，用高压力输送流动相，采用高效固定相及在线检测等手段的液相色谱法。 高效液相色谱 高效液相色谱仪 高效液相色谱法与经典液相色谱法 高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 103cm·min-1.例如分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。 高效液相色谱法与气相色谱法 气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。 气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，一般仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分的作用。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。 气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。 与气相色谱的区别 仪器---方法---操作（进样方法） 柱子 固定相 流动相 样品（不受挥发性的限制） 1.2 特点 与经典液相色谱法比较 分离性能好 分析速度快 灵敏度高 色谱柱可反复使用 与气相色谱比较 适用范围广 流动相可选择范围宽 流出组分容易收集 相对安全 (不使用高压气体、温度低) 总之 高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。 高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。 1.3 发展历史 古罗马时期分析染料与色素。1850年德国化学家Runge的改进，发展成纸色谱。 1903年 俄国植物学家 Tsweet 在华沙生物学会议上发表论文（分离植物色素） 20多年后，Kuhn 和Lederer用于从蛋黄中分离植物叶黄素，证实方法可行。色谱引起注意 液固色谱 瑞典 Tiselius（诺贝尔奖）和Claesson 30年代 薄层色谱法 1941年 英国生物化学家Martin与英国化学家Synge （诺贝尔奖）创立液液分配色谱 以水份饱和的硅胶为固定相，以含有乙醇的氯仿为流动相分离乙酰氨基酸 60年代 高压液相色谱的发展 仪器化----高压输液泵、光学检测器、微粒填充剂 70年代 高效固定相、装柱技术的发展 高压——高效 电导检测器与离子交换色谱法 80年代以后 相关学科的发展 （药物、农药、化工、染料……） 快速的普及应用 色谱专家系统 色谱—光谱联用、色谱—质谱联用、二维色谱（色谱—色谱） 1.4 分类 高效液相色谱法发展迅猛，新方法相继涌现，可以简单地分类如下： 按固定相的聚集状态分：液液色谱、液固色谱 按分离机制分：分配色谱、吸附色谱、离子交换、分子排阻、亲合色谱、化学键合相色谱及胶束色谱法等 1.5 高效液相色谱仪简介 高效液相色谱仪一般可分为4个主要部分： 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 此外，还配有辅助装置：如梯度淋洗 自动进样 数据处理等 1.5.1高压输液系统 1.5.2 进样系统 高效液相色谱法中对进样技术要求较严，常用六通阀进样。 有时用自动进样装置 1.5.3 分离系统——色谱柱 心脏部件，包括柱管与固定相 柱管常用不锈钢金属管 一般色谱柱长5～30cm，内径为2～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备柱内径较大，可达25mm以上。 一般在分离前有一个预柱，预柱内填充物和分离