ACP比活分析.pptVIP

小麦胚芽ACP活性测定 临床生物化学实验室 一、实验目的 掌握酸性磷酸酶（ACP）活性测定的原理和方法； 熟悉酶活性测定结果的计算。 二、实验原理 ACP的作用是能水解磷酸单酯键，释放无机磷酸。ACP的水解作用特异性不高，有ATP、ADP和G-6-P等为其天然底物，人工合成的底物有磷酸苯二钠、对硝基磷酸酚等。 二、实验原理 本实验利用提取液为酶制剂，以磷酸苯二钠作为底物，酸性环境中，在ACP的作用下，可水解生成酚和磷酸。在碱性溶液中酚能与4-氨基安替比林作用，经高铁氰化钾氧化生成红色醌类化合物，在波长510nm处测定其吸光度值，其颜色深浅与酚的含量成正比，通过比色测定可推算出酶的活性。 二、实验原理 三、实验试剂 酚标准贮存液(1 mol/L) ：用0.1 mol/L的HCl溶液配制，冰箱保存。 酚标准应用液(0.4 mmol/L) ：用酚标准贮存液加蒸馏水稀释而成。 0.1 mol/L碳酸盐缓冲液(pH 10.0) ：称取碳酸氢钠3.36 g，无水碳酸钠6.36 g，用蒸馏水溶解至1 000ml。 4-氨基安替比林(4-AAP)溶液：称取4-氨基安替比林6 g，用蒸馏水溶解并定容至1 000ml ，置棕色瓶中冰箱保存。 0.1 mol/L柠檬酸溶液：称取柠檬酸21.014 g，加蒸馏水溶解并定容至1 000ml。 三、实验试剂 高铁氰化钾溶液：称取硼酸28 g，高铁氰化钾 48 g，各自溶解于400ml 蒸馏水中，两液合并后再加蒸馏水至1 000ml，置棕色瓶中保存。 5 mmol/L磷酸苯二钠溶液：称取磷酸苯二钠0.635 g，加入500ml煮沸的蒸馏水中溶解，冷却后加氯仿2ml防腐，冰箱保存。 0.1 mol/L柠檬酸三钠溶液：称取柠檬酸三钠29.410 g，加蒸馏水溶解并定容至1 000ml。 0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液(pH 5.0)　每100ml缓冲液按0.1 mol/L柠檬酸三钠溶液59ml 加0.1 mol/L柠檬酸溶液41ml配制而成。 四、操作步骤 1.校正曲线的制作　 加入物(ml) B 1 2 3 4 5 酚标准液 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 碳酸盐缓冲液 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 4-AAP溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 铁氰化钾溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 相当于酚含量（nmol） 0 100 200 300 400 500 立即混匀后，室温放置10min,以B管调零,于510nm波长处比色，读取各管吸光度。以吸光度值为纵坐标，相应的酚含量为横坐标绘制校正曲线。 四、操作步骤 2.各上清液中ACP活性的测定 上清液标本的准备： 从各上清液中取0.5ml于另5支试管，再分别加入4.5ml蒸馏水进行10倍稀释。 四、实验操作 2.各上清液中ACP活性的测定 五、结果计算 1.酶活性单位换算 根据测得的各上清液吸光度值，从校正曲线上查出相应的酚含量，乘上稀释倍数，再换算出“μmol/(ml·min)”的活性单位。 酶活性单位= 其中，酶促反应的时间为15min，酶促反应中所用的上清液体积为0.1ml。 ACP活性单位的定义：每分钟每毫升酶液产生1nmol酚[nmol/(ml·min)]为一个活性单位。 五、结果计算2.酶的比活分析 蛋白质回收率（%）= ×100% 酶回收率（%）= ×100% 比活性= 纯化倍数= 五、结果计算数据记录表 总体积 蛋白质浓度 总蛋白 总蛋白回收 酶活性 总酶活性 总酶回收 比活性 纯化倍数 ml mg/ml mg % nmol/(ml·min) nmol/min % nmol/(min.mg) 上清液Ⅰ 上清液Ⅱ 上清液Ⅲ 上清液Ⅳ 上清液Ⅴ 六、注意事项 准确掌握酶促反应的时间，实验时要控制在同一条件下进行。 若上清液的酶活性过高，超过了校正曲线的线性范围，需要稀释后再测，结果乘上