siRNA靶向MIF重组逆转录病毒载体构建及稳定表达细胞株的筛选.pdfVIP

理生理杂志 ChineseJournalofPathophhysiolo 丝i!2；! 二 ! · 2195 · [文章编号] 1000-4718(2008)11—2195—05 siRNA靶向MIF重组逆转录病毒载体构建及 稳定表达细胞株的筛选水 戴 波 ， 肖定璋 ， 余细勇 (广东省人民医院医学研究中心，广东 广州510080；南方医科大学，广东 广州 510515) [摘 要] 目的：构建并鉴定巨噬细胞移动抑制因子(MIF)特异性 siRNA重组逆转录病毒载体 ，将其导入 PHOENIX细胞中，筛选出分泌 MIF—siRNA病毒的包装细胞 ，其分泌的病毒可以抑制 MIF蛋白的表达，并初步了解 稳定沉默MIF细胞株的特性。方法：体外合成含针对MIF特异基因序列的寡核苷酸并定向克隆入pSuper．retro逆 转录病毒载体，构建的载体通过酶切、测序鉴定后 ，采用脂质体介导转染包装病毒细胞株 PHOENIX，收获病毒上 清 ；将其感染HeLa细胞株，经过嘌呤霉素筛选得到抑制 M1F表达的HeLa细胞株。Westernblotting鉴定MIF表达 的抑制效果并通过迁移实验、软琼脂糖克隆形成实验比较HeLa—pSuper—MIF和HeLa—pSuper—mock之间的特 性。结果：构建了重组逆转录病毒载体pSuper—MIF，转染包装病毒细胞株PHOENIX，病毒上清感染HeLa细胞，抑 制了HeLa细胞内源性MIF蛋白的表达。沉默MIF蛋白后导致 HeLa细胞迁移能力下降，不依赖支持物生长的特 性减弱和黏附能力下降，同时稳定表达沉默MIF蛋 白的细胞株生长周期停留在Go／G。期与对照组相比凋亡减少。 结论：构建了重组逆转录病毒载体pSuper—MIF，转染包装细胞所产生的病毒上清，能够抑制 HeLa细胞内的MIF 蛋白表达，表明MIF对 HeLa细胞的迁移和不依赖支持物生长能力有重要作用。 [关键词] 巨噬细胞移动抑制因子；RNA干扰；逆转录病毒载体 [中图分类号] Q78 [文献标识码] A Constructi0n0frecombinantretroviralvectorofshortinterferingRNAs specificformacrophagemigrationinhibitoryfactor(M珂)andestablish· mentofstableHeLacelllinewith apersistentknockdown0fMIF DAIBo ，XIA0 Ding—zhang ，YU Xi—yong (ResearchCenterofMedicalSciences，GuangdongProvincialPeople’sHospital，Gnangzhou510080，China；Southern MedicalUniversity，Guangzhou510515，China．E—mail：dzhxiao@163．con) A『BSTRACT1 AIM ：ToconstructrecombinantretroviralvectorofshortinterferingRNAs(siRNA)specificfor macrophagemigrationinhibitoryfactor(MIF)andtoestablishthestableknockdownofMIFcelllineofmammalJancellsby transfectingtherecombinantretroviralvectors．METH0DS：We synthesized oligo—nucleotidesforMIF invitro，and clonedthem intoretroviralvectorpSuper．retro．Subsequentlytheplasmidsweresequencedanddigestedtoidentifythecon— strnctionoftherecombinantretroviralvectors．ThevectorsRNA