生物工程下游技术第三章_微载体培养技术.pptVIP

流感疫苗生产的大规模生产区域 (A) 细胞培养 (B) 离心分离(C) 超滤、洗滤。 Vero细胞流感疫苗生产图 (A) 未感染的细胞 (B) 早期细胞病变影响 (C) 收获前的晚期细胞病变 大规模流感病毒生产中细胞病变影响图片 * DEAE　葡聚糖凝胶　A-50：离子交换填料，纯化中等大小的生物分子（30-200KD）;表面包被薄层. 胶原基质的葡聚糖凝胶类微载体 * a.初期呈半球形，细胞轮廓清晰，球形饱满（接种后20分钟）；b.粘得不牢固，容易洗掉，留下痕迹（接种后30分钟）；c.细胞开始铺展，半球形变成扁平，轮廓模糊，边缘开始出现掕角（接种后60分钟）；d.细胞变成多边形或纺锤形，伸出伪足（接种后120分钟）；e.细胞迁移，寻找合适生存位置，留下尾迹；f.细胞膜与基质表面受力点不连续，接触面有间隙。 * (a)MCC细胞未铺展；(b)MCC细胞已铺展（因为有纤粘连蛋白充当桥梁作用）(c)Vero细胞呈纺锤形； (d)胞外基质成分层粘连蛋白促进Vero细胞铺展(e)胞外基质成分纤粘连蛋白促进Vero细胞铺展 * 驯化Vero细胞适应在用于大规模生产的无血清无蛋白培养基内生长。带有详细传代记录的Vero细胞冻存管被复苏；并传代到T形瓶和滚瓶中，生产出足够数量的细胞以接种Cytodex?3微载体生物反应器。细胞汇合后，细胞按照大约1:7的比例传代到后面的生物反应器。最终的细胞密度在2-3×106/ml。中试生产中最终的生物反应器规模是1200升。包括工艺设计，特殊的通气和搅拌装置，可以进一步放大到生产体积为6000升。在所有的生产开发过程中，从小量实验生物反应器到临床和商业化的生产用反应器，Vero细胞表现出相同的工艺水平 * 第三章 微载体培养技术（microcarrier culture technique） 一、何谓微载体？ 指直径60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。 一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。 最初采用在培养液中加人一定数量的小滚瓶，增加细胞生长的贴壁面积。 此方法构造简单，成本低，重复性好，放大过程可依靠滚瓶数量的增加。 但产率低，劳动强度大，占空间大。 如何增加细胞生长的贴壁面积？ 微载体系统 1967年被用于动物细胞大规模培养。 兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。 现广泛用于培养各类细胞，生产疫苗、蛋白质产品。 微载体培养系统 培养4h，微载体间的细胞“桥联” ×200 电镜下串在一起的肝细胞微载体×730 由于肝细胞的粘附作用微载体形成“串珠” ×400 脊髓灰质炎、狂犬和乙脑等疫苗 二、微载体的商品类型 第一种微载体： Van Wezel用DEAE-Sephadex A50研制而来 市售（国际）种类有十几种以上： 液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等 常用商品化微载体有三种： Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline 显微镜下的高密度微载体 优良的微载体应具有的特性 价廉，能重复使用。 不含能毒害细胞的成分； 微载体须与细胞有良好的相容性； 密度应略大于培养基； 粒径在40～120μm范围，生理盐水溶胀后增大到60~250 μm，粒度分布地均匀，径差不大于20~25μm； 良好的光学透明性； 能在PBS中耐120~125℃、20~30min高温灭菌； 应是非刚性材料； 不吸收培养基中的营养成分； 收获细胞或细胞制品容易，不影响蛋白质分离纯化； 三、微载体培养原理与操作 1、原理： 将对细胞无害的颗粒——微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。 丝网 微载体 通气的培养基 鼓泡器 搅拌叶轮 微载体培养装置图 ●微载体的大小：增大单位体积内表面积（S/F）对细胞的生长非常有利。使微载体直径尽可能小，最好控制在100-200μm之间。 ●微载体的密度：一般为1.03-1.05g/cm2，随着细胞的贴附及生长，密度可逐渐增大。 ●微载体的表面电荷：据研究，控制细胞贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质。若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷密度过大，反而会产生“毒性”效应。 细胞能否黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。 细胞增殖阶段：黏附贴壁、生长和扩展成单层 贴壁依赖性细胞在微载体表面上： 贴附是进一步铺展和生长的关键，主要是靠静电引力和范德华力 Vero细胞在Cytodex-3微载体表面粘附铺展的形貌变化 通常做法：贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌