目的基因获得.ppt

目的基因的克隆与基因文库的构建 A PCR法 B 基因文库的构建法 C 化学合成法 基因库（gene pool） 特定生物体全基因组的集合（天然存在） 基因文库（gene library or gene bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建） 根据构建方法的不同，基因文库分为： 基因组文库（含有全部基因） cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因） 基因文库构建的基本战略 构建基因组文库，材料来自染色体DNA 构建cDNA文库，材料来自mRNA 在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然， cDNA文库的信息量远小于基因组文库。 基因组文库的构建 基因组DNA的制备 为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。 鸟枪法克隆目的基因 1. 目的基因组DNA片断的制备 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。 当染色体DNA上目的基因区域的限制性酶切图谱未知时，采用合适这超声处理强度和时间，可以将切割的DNA片段控制在一定在大小范围内，其上限是载体的最大装载量，下限应至少大于目的基因的长度，否则无法在一个重组克隆中获得完整的目的基因。 一般来说，原核生物的基因长度大都在2kb以内，真核生物的基因长度变化很大，最大的基因可达100kb以上，因而将外源基因片段处理成略小于载体装载量上限的长度始终是正确的，外源DNA片段越大，后续筛选的规模越小。 外源DNA片段很难完整地从重组分子上卸下。 鸟枪法克隆目的基因 1. 目的基因组DNA片断的制备 全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控。 如采用识别序列为4个碱基对的限制性内切酶（如AluⅠ,MboⅠ）部分降解染色体DNA，这些限制性内切酶的识别顺序在任何生物基因组中频繁出现，因此只要采取合适的酶解条件就可能获得大片段的DNA分子。 DNA片段具有粘性末端，可以直接与载体分子拼接。 鸟枪法克隆目的基因 1. 目的基因组DNA片断的制备 部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。 如果染色体上DNA上目的基因的两侧含有已知的限制性内切酶识别位点，而且两者之间距离不超过载体装载量的上限，用这一（两）种限制性内切酶全酶解染色体DNA片段可能更为有利，所产生的片段呈非随机化，在某些程度上可以简化后续的重组和筛选操作。 鸟枪法克隆目的基因 2. 外源DNA片断的全克隆 根据外源DNA片段的末端性质和大小确定克隆载体，一般选择质粒或λDNA，受体细胞一般选择大肠杆菌。 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体。 如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体，受体细胞选择能使目的基因表达的受体细胞。 3.重组子的筛选与鉴定 抗生素抗性筛选 兰-白斑筛选 PCR筛选 DNA杂交筛选 鸟枪法克隆目的基因的局限性 工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 不能获得的最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构 cDNA文库的构建及目的基因的获得 1、cDNA文库的构建 （1）分离提取细胞总RNA （2）mRNA与其他RNA的分离，mRNA仅占总RNA的1~2%，可利用mRNApoly(A)与其他RNA分开。 mRNA与其他RNA的分离 (3) 以mRNA为模板反转录合成cDNA的第一条链 mRNA纯化后，加入oligo(dT)作为引物，以提供3’-OH引导DNA链的合成， 同时加入逆转录酶和四种dNTP，形成RNA-DNA杂合分子。 以mRNA为模板反转录合成cDNA的第一条链 （4）cDNA第二链的合成 自身引导法 获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺失 （4） cDNA第二链的合成 置换合成法 获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺失,还会有一小段RNA,但不影响后续的克隆操作。 cDNA第二链的合成 引导合成法获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列 cDNA法克隆目的基因的基本战略 （5）双链cDNA的克隆 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收 cDNA法分离目的基因 差异分离 将两种不同组织来源的mRNA进行比较，用扣除杂交（subtractive hybridization)排除相同部分，即共