宫颈癌前病变及宫颈癌组织中P16INK4A基因的表达及其和人乳头瘤病毒感染的关系.docVIP

宫颈癌前病变及宫颈癌组织中P16INK4A基因的表达及其与人乳头瘤病毒感染的关系 邹先进 蔡 兰 刘 颖 王 梅 谢军花 目前，对宫颈癌前病变的诊断，主要采用宫颈细胞涂片和活体组织学检查等形态学方法。对有些癌前病变，因受观察者主观因素影响，难以做出精确诊断[1]。因此，寻找除人类乳头瘤病毒以外的生物标志物，用于宫颈癌前病变的辅助诊断，就显得较为重要。我们采用免疫组织化学链霉菌抗生物素-过氧化物酶（SP）方法，检测P16INK4A基因在不同宫颈病变中的表达状况，以观察其能否作为宫颈癌前病变生物标志物。同时，采用荧光定量PCR（Fluorescence quantitative ＰＣＲ，FQ-PCR）方法，检测HPV16、18型DNA，观察P16INK4A在宫颈癌前病变及宫颈癌中的表达与HPV16、18型感染的关系。 材料和方法 1．标本来源：随机抽取我院病理科1992—2002年11月活检或手术切除宫颈石蜡包埋标本：鳞状细胞癌110例；宫颈上皮内瘤变（CIN）100例，其中CINⅠ级59例，CINⅡ级23例，CINⅢ级18例；慢性宫颈炎40例；正常宫颈30例（非宫颈病变手术切除标本）。 2．试剂来源：P16INK4A单克隆抗体（美国加利福利亚Neomarkers公司生产），生物素标记的第二抗体及链霉菌抗生物素—过氧化物酶溶液（SP免疫组化染色试剂盒）均购于福州迈新生物技术开发公司。HPV16、18PCR检测试剂盒，购于广州中山医科大学达安基因有限公司。 3．免疫组化染色方法：所有标本均经10%甲醛液固定，石蜡包埋，切片厚4μm。免疫组化染色采用SP法,按说明书操作（P16INK4A（2ug/ml）单克隆抗体1：100稀释，4℃过夜）。 4.染色观察标准：细胞核或细胞浆内出现有棕黄色颗粒为阳性。按其着色有无及强弱程度划分为：阳性细胞5%或无阳性着色为阴性（—）；阳性细胞6%~25%为（十），阳性细胞26%~50%（十十），阳性细胞50%为（十十十）。 5.标本HPV DNA提取：石蜡包埋标本切5μm厚切片5-8片放入1.5ml无菌试管内，加入1ml二甲苯,置37℃恒温箱内脱蜡30min，重复2次，用无水乙醇，无菌生理盐水洗涤。所有标本均采用常规碱裂解法提取HPV DNA。 6.FQ-PCR HPV16.18型扩增：各反应管放入PE7700自动荧光PCR检测仪（ABI prism 7700 Sequence Detector,美国Perkin Elmer公司）。按下列条件扩增：93℃2分钟预变性，然后按93℃45S—55℃120S，共做40个循环。反应结束后，由电脑自动分析计算出结果。定量结果采用求算对数平均值的方法来计算HPV16.18型DNA平均拷贝数，阴性结果不参加平均值的统计。 作者单位： 448000 湖北省荆门市第一人民医院病理科（邹先进 蔡兰 刘颖 谢军花），妇产科（王梅）。 电话：0724 2305787。Emal: xjz6074@ 结果 1.P16INK4A免疫组化染色结果：110例宫颈鳞状细胞癌P16INK4A表达均为阳性（见图1），其中94例为十十十，16例为十十。原位癌累及腺体的病灶中，P16INK4A在癌组织中过度表达，而在残存的正常腺上皮不表达（见图2）。在59例CINⅠ级P16INK4A着色强度较弱，其中27例为十，21例为十十，10例为十十十，1例为阴性。在41例CINⅡ、Ⅲ级中，9例为十十，32例为十十十。所检测的30例正常宫颈及40例慢性宫颈炎标本，P16INK4A染色均为阴性。P16INK4A在CIN病灶中呈过度表达，而在邻近的正常细胞不表达，两者区分清楚。（见图3、4）。在P16INK4A呈阳性表达的58例CIN I级标本中，49例表层细胞P16INK4A不表达，9例表层细胞P16INK4A呈过度表达（见图5、6）。 2.FQ—PCR检测HPV（16.18）DNA结果：110例宫颈鳞状细胞癌检测出HPV（16.18）DNA阳性79例，阳性率71.8%。CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ级检测出HPV（16.18）DNA阳性率分别为46%(27/59)、70%(16/23)、72%(13/18)。40例慢性宫颈炎HPV（16.18）DNA阳性1例，正常宫颈标本未检测出HPV（16.18）DNA。 3．我们观察到，在宫颈鳞状细胞癌及CIN HPV16、18型DNA呈阳性的标本，P16INK4A表达均呈阳性。同时，我们还观察到，在宫颈病变中，HPV16、18型DNA阳性率愈高，则P16INK4A表达的强度愈高（见表），相关系数r=1。 讨论 1．我们的实验结果表明P16INK4A在宫颈癌及CIN病灶中过度表达，而在邻近的