人膀胱浅表性移行细胞癌基因表达变化的基因芯片的研究.docVIP

人膀胱浅表性移行细胞癌基因表达变化的基因芯片研究 　　作者：史本涛 作者单位：西安交通大学泌尿外科研究所，陕西西安 710061 　　【摘要】 目的 研究人膀胱浅表性移行上皮细胞癌(TCC)和正常膀胱组织差异表达基因。方法 应用基因芯片技术对6例膀胱浅表性TCC癌组织和正常膀胱组织的总RNA进行检测。结果 在13939条目的基因中共发现差异表达基因720条。在癌组织中234条表达增加，486条表达降低；678条能在Gene Bank中登录。结论 膀胱浅表性TCC的发生、发展是多基因异常引起多条传导通路异常致使细胞恶性转化的结果，基因芯片技术可同时定量研究大量基因表达水平，是一种稳定、高效的方法。 　　【关键词】 膀胱肿瘤 移行细胞癌 基因芯片 　　膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，具有复杂的生物学行为，临床上有不同的表现形式和预后。其中75%为浅表性移行细胞癌，复发率为40%-60%，复发者中约有20%可发展为浸润性癌。膀胱癌患者预后差, 早期诊断和治疗尤为重要。我们利用高通量、高灵敏度的基因芯片技术，对膀胱浅表性移行细胞癌(transitional cell carcinoma, TCC)及正常膀胱组织的基因表达进行了筛选和分析，以利于更进一步的膀胱癌分子生物学研究。 　　1 材料与方法 　　1.1 取材 6例膀胱浅表性TCC组织取自西安交通大学第一医院泌尿外科2003年7月-2004年6月手术切除标本，均经病理证实。患者年龄48-72岁，平均58岁。病理分级：G1 5例、G2 1例。TNM分期：T1 6例。正常膀胱组织取自6例良性前列腺增生患者的正常膀胱黏膜。取材后立即用液氮保存。 　　1.2 RNA抽提及鉴定 采用改良酚氯仿一步法抽提总RNA。以分光光度计检测其吸光度值(A)，并行热稳定试验，于-80℃和70℃保温1h后分别电泳检测28S、18S条带变化。 　　1.3 预杂交和探针制备 将配制好的预杂交液放入95℃水浴锅内变性2min，将待预杂交的玻片放入95℃水浴锅内变性30s，玻片取出后即放入无水乙醇中30s，晾干。将已变性的预杂交液加到玻片的点样区域内，盖上盖玻片，放入杂交箱内42℃预杂交5-6h。参照Schena等[1]方法逆转录标记cDNA。Cy32dUTP标记正常膀胱组织mRNA，Cy52dUTP标记浅表性TCC组织mRNA。 　　1.4 表达谱芯片的制备 芯片型号为BiostarH140s，由上海博星基因芯片有限责任公司提供。芯片包含14112个靶基因的cDNA克隆，其中待检测基因数13939条，阳性对照为人管家基因，共96条，阴性对照为水稻基因，共16条，内参是不同浓度的人管家基因，共20条，空白对照共41条。以通用引物进行PCR扩增。 　　1.5 杂交及洗涤 将基因芯片和杂交探针分别于95℃水浴锅内变性后置于杂交舱内，加入混合探针，用杂交密封舱加以密闭，不留有气泡。于60℃恒温杂交箱内杂交18h。依次用2×标准枸橼酸盐水(SSC)溶液+2g/L十二烷基硫酸钠(SDS)溶液、1g/L SSC溶液+2g/L SDS溶液及1g/L SSC溶液分别洗涤10min，室温晾干。 　　1.6 差异基因检测与生物学信息分析 用General Scanning公司的ScanArray4000扫描芯片。ImaGene3.0软件分析Cy3、Cy5荧光信号强度，计算Cy5/Cy3值。阳性结果判断：①Cy5/Cy33.0或0.3；②该基因点的Cy3、Cy5信号值皆大于200，或者其中之一大于800；③该基因点的Cy5信号值/Cy3信号值的比值为0.1-10。 　　2 结果 　　2.1 总RNA的提取和总RNA完整性的鉴定 抽取的总RNA A260/A2801.9，热稳定试验70℃保温1h与保温前-80℃电泳条带比较，显示28S条带无明显降解，说明提取总RNA的完整性较好，没有降解(图1)。 　　图1 总RNA质量控制电泳图（略） 　　T, T′：浅表性膀胱癌组织总RNA；N, N′：正常膀胱组织总RNA；T, N：保温前-80℃的总RNA；T′, N′：70℃保温后的总RNA 　　2.2 基因芯片杂交结果可靠性的控制 ①严格取材，每例膀胱癌在同一部位取新鲜无坏死的癌组织(癌细胞占细胞总数75%)两部分，一部分作基因芯片，另一部分作病理切片。正常膀胱组织取自良性前列腺增生患者的膀胱黏膜，标本迅速置于液氮中，同时抽提实验样本的RNA，且质量一致。②6例膀胱癌组织各取等量总RNA组成RNA混合池；同时取6例正常膀胱组织等量总RNA组成RNA混合池。 　　2.