甾体微生物羟化的耐温菌选育及转化条件研究.pdfVIP

维普资讯 中国医药工业杂志 Ci~eseJo~nalofPharmaceuticals2006，37(12) 甾体微生物羟化的耐温菌选育及转化条件研究 周英俊 ，郑 璞 ，孙志浩，郭一平 (1．江南大学生物工程学院生物催化研究室，江苏无锡214036：2．浙江天台药业，浙江天~317200) 摘要t采用∞Co射线对黑根霉SW3．4l孢子进行诱变，筛选得到能在34~C生长并转化生产110-【羟基．160，【17ct-环氧孕酮的 菌株SW3．41．11-51。同时研究其转化工艺 结果表明，在加入终浓度12gL／fl~底物和3％的吐温-80条件下，以耐温黑根霉 SW3．41．1151转化43h的转化率达~J143％，得到4．5gL／产物。 关键词t甾体；孕酮；lltx．羟化反应：诱变；黑根霉 中豳分类号：Q939．93 文献标识码：A 文章编号：1001-8255(2006)12-0811-04 在甾体药物的合成中，1l-羟基的引入常采用 3H，O，0．5，NaC10．5，琼脂2．5：pH6．7～7．0。 微生物转化法。其中黑根霉 (Rhizopusnigricans) 摇瓶培养基／％；葡萄糖3，玉米浆3，硫酸铵 对16or，17or．环氧孕酮 (1)的l10L．羟化是最早的成功 0．13：pH4．1～4．3。 实例n] 国内于1958年用黑根霉菌株氧化1，引入 2 方法与结果 11a．羟基制得了醋酸可的松工业化生产所需的关键 2．1测定方法 中间体2【 黑根霉最适生长转化温度为26~28~C， 样品以HPLC分析，色谱条件：色谱柱 Ijch蛳 升至34~C时则停止生长口。为适应夏季生产，研究 100RP．C]8柱 (4ram×125ram，5m)；流动相 甲 了耐温黑根霉的选育及其转化1的条件。 醇．水 (7：3)：检测波长 240rim；柱温 30℃：流 1仪器与材料 速 1ml／min。用外标法定量，待测样品进样前经 1．1仪器 0．45pm~微孔滤膜过滤处理。 HP1100型高效液相色谱仪 (美国惠普公司)。 2．2 黑根霉培养及其转化1的方法 1．2菌种与试药 将接种黑根霉的小米斜面培养基于28℃培养 黑根霉SW3．41(浙江天台药业提供) 6d。无菌水清洗斜面得到孢子悬液，以接种量10 l~lla-羟基-16a，17a-环氧孕酮对照品均由浙江天台药 接入摇瓶培养基中，于28或34℃摇床 (150r／min)培 业提供。 养18~23h，加入底物1，摇床培养36~43h，得到 1．3培养基 羟化产物。 斜面培养基；新鲜小米洗净后浸泡30min，取 2．3 ∞Co诱变筛选耐温菌 500g~JI1水35g，105~110~C灭菌15min，冷却后试管 2．3．1印Co选育 分装，以lkg压力120~C灭菌30min。 采用3种不同强度的卸Co射线 (3万、6万和9 平板培养基／％：葡萄糖1，酵母膏1．5，K2HPO4- 万伦琴，照射距离10cm)照射黑根霉SW3．41。将 照射后的孢子悬液转至250ml摇瓶后于34~C培养， 收稿 日期t2005．10-28 稀释后涂布平板培养基。由于耐温菌株在34~C得 作者简介：周英俊(1979)，男，硕士研究生．专业方向；生物催