联合基因（CD和TNF-α）治疗喉癌的实验的研究.pdf

中山大学硕士论文(2008) 联台基冈(CD和TNF．a)治疗喉癌的实验研究 联合基因(CD和TN卜程)治疗喉癌的实验研究 专 业： 耳鼻咽喉科学 硕士研究生： 粱伟英 导 师：柴丽萍主任医师 中由大学附属第一医院耳鼻咽喉科医院 中文摘要 研究背景和目的： 喉癌是最常见的头颈恶性肿瘤之～，全球每年约有190，000例新增喉癌病例， 并且其发病率有增高趋势。晚期喉癌经手术或术后辅以放疗或化疗的5年生存率不 足60％，术后造成喉功能全部或部分丧失，生活质量明显下降，严重的威胁着人类 的生命和健康。 基因治疗是治疗恶性肿瘤的最具有潜力的新方法，由手瓣瘤酶发生、发展及转 移是多因素及多阶段的复杂过程，联合基因治疗可从多个环节控制肿瘤的发生及发 展，提高基因治疗的肿瘤抑制率和抗肿瘤免疫效应，降低其毒副作用。目前国内外 学者进行的有关联合基因抑制肿瘤的实验，均存在联合基因构建操作复杂，容易突 变，肿瘤抑制效果不理想，选择的基因治疗窗小等不足，同时未见有胞嘧啶脱氨酶 necrosisfactor一 (cytosinedeaminase，CD)基因联合牌瘤坏死因子一壤(toumor 旺，TNF—CI)基因治疗喉癌的实验研究。 合成，使靶细胞走向死亡。TNF-Q能充分调动机体的抗肿瘤兔疫反应，对肿瘤有直 接杀伤作用，损伤肿瘤组织微瞧管。两释基因的肿瘤抑制机制不同，露且有协同作 用，因而可以从多个环节抑制肿瘤生长，达到优势互补，提高肿瘤抑制率及抗肿瘤 中山大学硕士论文(2008) 联合基因(CD和TNF．a)治疗喉癌的实验研究 免疫反应的目的。 井源性基因表达的强启动予；并盛本研究所插入的目的基因CD和TNF-往片段小， 仅有1284bp和687bp，操作简单。 本研究通过构建自杀基因CD联合细胞因子TNF—Q基因共表达的非病毒载体 并导入喉癌Hep一2细胞，观察eD基因和l鹣F-Q基因共表达产物在5一雕作用下 于体内外对喉癌细胞系Hep一2的杀伤作用并研究其作用机制。 研究方法： 2000介导下分别转染喉癌细胞Hep一2，G418筛选出抗性克隆并 Lipofectamine Hep一2／0，RT—PCR检测各目的基因的表达。 3。MTT法检测体外细胞杀伤作用。 4．湃T法检测旁观者效应。 5．流式细胞仪检测细胞凋亡率。 组入喉鳞癌裸鼠皮下移植瘸模型。细胞接种的第8天(移植瘤直径约5mm)开始， 每天腹腔给予5一FC，连续12天。比较给药前后肿瘤体积变化、肿瘤倍增时间及 抑瘤率，通过病理切片观察组织病理变化。 中山大学硕士论文(2008) 联合基因(CD和TNF．Q)治疗喉癌的实验研究 7．统计学方法：采用SPSSl2．0统计软件。数据以均数±标准差(X±S)表 示，用单因素方差分析，以P(O．05为差异有统计学意义。 结果： 1．目的基因真核表达载体的构建及细胞转染 联合基因的大小、位置、方向均正确无误。 1-2RT-PCR证明各重组外源基因在已转染目的基因真核表达载体的喉癌细 胞系Hep-2中均有表达。 2．体外实验 2．1体外细胞杀伤实验Hep一2／TIC组的细胞杀伤作用最强，其杀伤作用呈浓 Hep一2／TNF—a和Hep一2／O组细胞未显示出旁观者效应。 细胞中以Hep-2／TIC组的凋亡率最高，四组两两之间比较差异均有显著性 (尺O．05)。 3．体内实验 中山大学硕士论文(2008) 联合基因(CD和TNF．a)治疗喉癌的实验研究 3。1人喉鳞癌裸鼠皮下移植癔模型的构建经典的皮下种植方法成功构建人 喉鳞癌裸鼠皮下移植瘤模型，细胞注射数量为5×106，成瘤率83％，成瘤时间6-8 天。 四组裸鼠中，Hep-2／TIC组裸鼠移植瘤的倍增时间最长、生长速度最慢、治疗后 移植瘤平均体积最小，抑瘸率达97。40％，其中有一只裸鼠移植瘤完全消除。 3．3移植瘤的组织病理学 3．3．圭Hep-2／TIC组：移植瘤内见大量蒡孛瘤组织坏死，有较多淋巴细麓浸润， 肿瘤细