红树林共附生菌实验方案.docVIP

研究红树林内大型藻类共附生菌的实验方案 红树林内大型藻类采样 到湛江的红树林区（如东海大堤）采集藻类，通过分类根据实验需要再选取其中的某一种作为实验材料。 二、试验方法 1、研磨匀浆法 用无菌海水冲洗样品3次，去掉非附着生物，用灭菌纱布吸干藻体表面水分，用无菌剪刀剪取10g的湿样（均匀藻样）并将其剪碎，至无菌研钵中研磨，磨碎后用90ml盐度15~20的无菌海水少量多次的将其洗入150ml无菌三角瓶中（瓶中含有玻璃珠）。取上清液并用试管对其进行梯度稀释，制成10-1、10-2、10-3 稀释度的菌悬液，用灭菌移液枪吸取100μL菌悬液在平板上均匀涂布，每一梯度重复4个板。放入28℃恒温箱培养，分别于36h、48h、72h三次进行菌落计数，根据下述公式进行换算得每g鲜重海藻所得的细菌密度(BN，cells/g): BN=V·[10x10-1cfu+100×10-2cfu]/(6xW) 其中:BN为单位海藻重量所分离的菌落数(cells/g)，V为处理液的体积(mL)，10-1 cfu、10-2cfu分别为10-1、10-2稀释梯度平板上36h、48h、72h三次计数最多一次的菌落个数，W为海藻鲜重(g)。及时挑取形态不同的菌落，进行纯化培养， 直到没有新的菌落长出，该过程约持续1周。对于纯化培养的细菌要对其进行保存，并对其菌落进行形状、大小、颜色、革兰氏染色观察和描述，以便进行常规鉴定和分子鉴定。 2、研磨匀浆与旋涡振荡法联用 用无菌海水冲洗样品3次，用无菌剪刀剪取10g的湿样（均匀藻样）并将其剪碎，至无菌研钵中研磨，磨碎后用90ml盐度15~20的无菌海水少量多次的将其洗入150ml无菌三角瓶中（瓶中含有玻璃珠）；将三角瓶放在旋涡振荡器上振荡，作用时间6分钟，稍静止。取上清液并用试管对其进行梯度稀释，制成10-1、10-2、10-3 稀释度的菌悬液，用灭菌移液枪吸取100μL菌悬液在平板上均匀涂布，每一梯度重复4个板。放入28℃恒温箱培养，分别于36h、48h、72h三次进行菌落计数，根据公式换算每g鲜重海藻所得的细菌密度。及时挑取形态不同的菌落，进行纯化培养，直到没有新的菌落长出，该过程约持续1周。对于纯化培养的细菌要对其进行保存，并对其菌落进行形状、大小、颜色、革兰氏染色观察和描述，以便进行常规鉴定和分子鉴定。 3、研磨匀浆与超声波粉碎法联用 用无菌海水冲洗样品3次，用无菌剪刀剪取10g的湿样（均匀藻样）并将其剪碎，至无菌研钵中研磨，磨碎后用90ml盐度15~20的无菌海水少量多次的将其洗入150ml无菌三角瓶中（瓶中含有玻璃珠）；进行超声波粉碎，功率30W作用时间30s，稍静止。取上清液并用试管对其进行梯度稀释，制成10-1、10-2、10-3 稀释度的菌悬液，用灭菌移液枪吸取100μL菌悬液在平板上均匀涂布，每一梯度重复4个板。放入28℃恒温箱培养，分别于36h、48h、72h三次进行菌落计数，根据公式换算每g鲜重海藻所得的细菌密度。及时挑取形态不同的菌落，进行纯化培养，直到没有新的菌落长出，该过程约持续1周。对于纯化培养的细菌要对其进行保存，并对其菌落进行形状、大小、颜色、革兰氏染色观察和描述，以便进行常规鉴定和分子鉴定。 4、研磨匀浆、超声波粉碎与旋涡振荡法联用 用无菌海水冲洗样品3次，用无菌剪刀剪取10g的湿样（均匀藻样）并将其剪碎，至无菌研钵中研磨，磨碎后用90ml盐度15~20的无菌海水少量多次的将其洗入150ml无菌三角瓶中（瓶中含有玻璃珠）；进行超声波粉碎，功率30W作用时间30s；再将三角瓶放在旋涡振荡器上振荡，作用时间6分钟，稍静止。取上清液并用试管对其进行梯度稀释，制成10-1、10-2、10-3 稀释度的菌悬液，用灭菌移液枪吸取100μL菌悬液在平板上均匀涂布，每一梯度重复4个板。放入28℃恒温箱培养，分别于36h、48h、72h三次进行菌落计数，根据公式换算每g鲜重海藻所得的细菌密度。及时挑取形态不同的菌落，进行纯化培养，直到没有新的菌落长出，该过程约持续1周。对于纯化培养的细菌要对其进行保存，并对其菌落进行形状、大小、颜色、革兰氏染色观察和描述，以便进行常规鉴定和分子鉴定。 5、荧光显微计数和藻类样品的含水量及水分系数 接种做完后的150ml三角瓶样品，加甲醛（当作100%浓度）固定、保持终极浓度4%（体积比），进行荧光显微计数。另取10克左右的湿藻样，置于烘箱80℃烘至恒重，称重，计算样品的含水量和水分系数。 三、所需平板培养基的配制 (1)、海洋细菌培养基Zobell 2216E ： 酵母膏2g，FePO3 0.05g，蛋白胨10g海水定容1000mL，琼脂20g，pH 8.0。 (2)、海洋真菌培养基: 马丁氏琼脂培养基 葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，