新型鸭呼肠孤病毒的鉴定及其全基因组序列解析.pdfVIP

AnhuiAgriculturalUniversity DissertationfortheMasterate IdentificationandSequenceDeterminationofNovelDuck Reovirus Candidate:ZhuYingqi Supervisor:Prof.LiuGuangqing CooperantSupervirsor:Prof.WangGuijun AcademicDegreeappliedfor:MasterofAgriculture Speciality:PreventiveVeterinaryScience Researchfield:Infectiousdiseasesofdomesticanimals Co ege:Anima ScienceandTechnologyCo ege June,2013 中文摘要 2011 年上半年，中国太湖流域的许多养鸭场陆续发生一种新的鸭病毒性传染病， 临床主要表现为发病雏鸭精神萎靡，软脚，排白色稀粪，发病率约40%，病率在 35%-40%以上，给养鸭业造成了较为严重的经济损失。 为了分离该病的病原，我们从太湖发病鸭场采集发病鸭实质脏器，通过接种SPF 鸡胚进行病毒分离。结果从鸡胚尿囊液中分离到一株病毒，经测定该病毒尿囊液的 5.5 ELD 为10 /0.2mL。将该病毒尿囊液感染 1 日龄樱桃谷肉鸭可复制出与临床相同的 50 症状，且可从发病鸭的脾脏和肝脏中分离到病毒，该结果表明我们分离到的病毒为造 PCR RT-PCR 成这次疾病发生的病原。通过 、 检测方法对该病毒进行检测，结果排除 了所有常见的或者是具有地方流行特点的鸭病毒性传染病，包括鸭病毒性肠炎病毒、 鸭肝炎病毒、禽流感病毒、鸭黄病毒、鸭细小病毒和番鸭呼肠孤病毒。 为了确定该病毒的分类学地位，首先，我们通过病毒核酸类型的鉴定、有机溶剂 敏感性试验和血凝性试验证明该病毒为RNA病毒、无囊膜、不具有鸡血红细胞凝集 活性。然后，将病毒尿囊液经蔗糖密度梯度离心纯化进行电镜观察，发现该病毒粒子 直径约70nm、呈球形、正二十面体对称和双层衣壳结构，病毒具有典型的正呼肠孤 病毒科成员的特性。最后，我们参考番鸭呼肠孤病毒 （Muscovyduckreovirus,MDRV） 89026株S2基因的部分序列设计合成了一对引物，对该病毒的核酸序列进行了测定， 同时对该序列进行遗传进化分析，结果表明该病毒与2009年从福建分离到的新型鸭 呼肠孤病毒(Duckreovirus，DRV)NP03株亲缘关系很近处在同一进化分支，而与番鸭 呼肠孤病毒亲缘关系较远。至此，我们分离并鉴定出造成鸭群中这次疫病流行的病原 为新型鸭源呼肠孤病毒。根据国际命名规则，将该病毒命名为新型鸭呼肠孤病毒太湖 2011株（DRVTH11）。 为了了解该病毒的增殖特性，我们将病毒感染BHK-21细胞系，对其一步生长曲 线进行了测定。研究表明DRVTH11株病毒可在BHK-21细胞系上增殖 出现细胞巨, 融合病变，通过WB、IFA方法均能在细胞内检测到该病毒的存在。一步生长曲线显 示，该毒株感染BHK-21细胞后0-12h为潜伏期，12h后开始增殖，12-36h进入快速 6.57 48h TCID 10 /0.1mL 增殖期， 病毒滴度即达到最高， 50为 ，随后病毒的增殖随细胞 的崩解而降低。 为了了解该病毒分子遗传信息，我们通过RT-PCR方法对病毒基因组进行扩增， 成功获得覆盖DRVTH11株病毒全基因组的若干目的片段克隆。序列拼接后显示病毒 基因组全长为23,418bp，病毒基因组有十个基因片段组成，大小如下：L1,3958bp； L2