氨基酸的分离与鉴定.docVIP

实验一 氨基酸的分离与鉴定——滤纸层析法 目的要求 （1）通过实验，了解氨基酸滤纸层析法的原理。 2）掌握氨基酸滤纸层析的操作方法。 理 滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析（它也并存着吸附和离子交换作用）。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动称为下行层析，自下而上流动称为上行层析。流动相流经支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。 溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示： 溶质结构、溶剂系统物质组成与比例、pH值、选用滤纸质地和温度等因素都会影响Rf值。此外，样品中的盐分、其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。 无色物质的纸层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定。氨基酸纸层析图谱常用的显色剂为茚三酮或吲哚醌，本实验采用茚三酮为显色剂。 本实验用单向上行层析法作标准氨基酸的标准曲线，用双向上行纸层析法作几种已知氨基酸的层析图谱。然后将其中的谷氨酸和天冬氨酸加以定量测定。 试剂和器材 一、试剂 （1）8×10-3mol/L谷氨酸和8×10-3mol/L天冬氨酸混合液。 （2）谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸和丙氨酸混合液（已知氨基酸混合液）。将以上氨基酸分别配制成8×10-3mol/L的浓度，然后混合之。 （3）茚三酮重结晶方法：茚三酮有时由于包装不好或放置不当常带微红色，需重结晶方可使用。5g茚三酮溶于15mL热水，加入0.25g活性炭轻轻搅动，若溶液太浓不易操作，可酌量加5—10mL热水，加热30min后趁热过滤（用热滤漏斗，以免茚三酮遇冷结晶而损失），滤液置冰箱内过夜，次日晨即见黄白色结晶出现，过滤，再以1mL冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，最后装入棕色瓶内保存。 （4）0.1%硫酸铜（CuSO4·5H2O） ：75%乙醇=2 ：38 硫酸铜难溶于乙醇，将硫酸铜直接用75%乙醇溶解不能得到澄清溶液，如将硫酸铜溶液和乙醇混合后，放置过久则会有沉淀析出，因此，必须在临用前按比例混合。 正丁醇（需重蒸），95%乙醇，88%甲酸，12%氨水（因氨易挥发，稀释前需测出毕重）。0.5%茚三酮丙酮溶液。 二、器材 新华中速薄层析滤纸，层析缸（高约430mm，直径约290mm，具有磨口盖子），鼓风恒温箱，国产72型分光光度计，水浴锅，喷雾器，电吹风机，点样架，点样管，加溶剂的漏斗，针、线和尺子，橡皮（或线）手套，结晶皿。 操作方法 滤纸的剪裁 选用国产新华1号滤纸，剪裁成28cm×28cm，在滤纸上距相邻的两边各2.0cm处用铅笔轻轻划两条线，在线的交点上，点样(图1.1)。 图1.1 滤纸的剪裁 点样 已知氨基酸混合液点样量30—40μL为宜。将准备好的滤纸平放在干净的玻璃板上。用定量点样毛细管准确吸取样品到一某一刻度，与滤纸垂直方向轻轻碰点样处，点子的扩散直径控制在0.5cm以内。点样过程中必须在第一点样品干后再点第二滴。为使样品加速干燥，可用电吹风机吹干，注意温度不宜过高，避免破坏氨基酸，影响定量结果。 将点好样品的滤纸两侧边缘比齐，用线缝好，揉成筒状(图1.2)。注意缝线处纸的两边不能接触，以免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。 图1.2 图1.3 展层 将圆筒状的滤纸放入结晶皿，注意滤纸不要与皿壁接触，皿周围放3个小烧杯，内盛平衡溶剂，盖好盖子，平衡1h后打开盖子少许，用移液管（管下端接触到结晶皿底部）加入层析溶剂（展层剂），取出移液管时勿使它碰纸。当溶剂展层至距离纸的