蛋白质与核酸的定性与定量实验方法资料.docVIP

蛋白质与核酸的定性与定量 实验目的 学习和掌握纯化蛋白质的原理和方法、蛋白质等电点的测量原理和方法。 进一步掌握使用双缩脲法对蛋白质的定性测定、利用定糖法对核酸的定性与定量测定 实验原理 蛋白质的定性测定：双缩脲法，课本P99 蛋白质的定量测定：Folin-酚法，实验P19 核酸的定性与定量测定：定糖法，课本P131、 蛋白质等电点的测量 在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带pH梯度的组成 　　pH梯度的组成方式有二种，一种是人工pH梯度，由于其不稳定，重复性差，现已不再使用。另一种是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物，在正极端吸入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在负极端引入碱液，如氢氧化钠、氨水等。电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值，即各段介质中的pH相等，用pH0表示。电泳开始后，混合物中pH最低的分子，带负电荷最多，pI1为其等电点，向正极移动速度最快，当移动到正极附近的酸液界面时，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI1，这一分子不再向前移动而停留在此区域内。由于两性电解质具有一定的缓冲能力，使其周围一定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围。pH稍高的第二种两性电解质，其等电点为pI2，也移向正极，由于pI2＞pI1，因此定位于第一种两性电解质之后，这样，经过一定时间后，具有不同等电点的两性电解质按各自的等电点依次排列，形成了从正极到负极等电点递增，由低到高的线性pH梯度。 编辑本段两性电解质载体与支持介质 　　理想的两性电解质载体应在pI处有足够的缓冲能力及电导，前者保证pH梯度的稳定，后者允许一定的电流通过。不同pI的两性电解质应有相似的电导系数从而使整个体系的电导均匀。两性电解质的分子量要小，易于应用分子筛或透析方法将其与被分离的高分子物质分开，而且不应与被分离物质发生反应或使之变性。 　　pH梯度制作利用的两性电解质（ampholyte，商品名为ampholine），是脂肪族多胺和多羧类的同系物，他们具有相近但不同的pKa和pI值。在外电场作用下，自然形成pH梯度。 　　凝胶可用：聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等DEAE-Cellulose离子交换： 氨基酸、蛋白质、核酸等大多是两性物质，在水溶液中带有电荷，由于生物分子自身的性质差异，造成了特定的介质中所带的点和种类和密度不同，这就是离子交换的理论依据。 离子交换现象可用下面的方程式表示： Resin-SO3H+Na+H+ Resin-SO3Na+H+=Resin-SO3H+Na+\ 阴离子交换反应： Resin-N(CH3)3OH+Cl-=n(ch3)3Cl-+OH- 二乙基氨基纤维素DEAE/view/9901378102d276a200292e37.html 实验材料 试剂 双缩脲试剂实验P13 Folin-酚试剂，实验P19 地衣酚试剂、二苯胺试剂 0.02mol/LNH4Ac、0.06mol/L NH4Ac流洗、0.3mol/L NH4Ac、1.5mol/LNaCl- 0.3mol/LNH4Ac 器材 紫外检测仪、自动部份收集器、记录仪 Manifold聚焦盘电极平台样品杯1. 平衡:0.02mol/LNH4Ac缓冲液平衡离子交换柱，紫外检测仪、记录仪基线稳定; 2. 上样:取下柱上端套塞，当柱上液面与凝胶床面相切，立即将样品小心而缓慢地加到柱床表面; 3.洗涤:样品降至床面，用0.02mol/LNH4Ac洗涤柱壁1次; 4. 收集γ-球蛋白:将0.02mol/LNH4Ac缓冲液充满层析柱，与高位恒压槽连通，开启自动部分收集器进行收集； 5. 洗涤其他球蛋白:记录仪基线恢复到零后,用0.06mol/L NH4Ac流洗，不用进行收集 6.收集白蛋白:待记录仪基线恢复到零后，用0.3mol/L NH4Ac缓冲液流洗，自动部分收集器进行收集; 7. 柱上再生:待记录仪基线恢复到零后,用1.5mol/LNaCl- 0.3mol/LNH4Ac流洗，不用进行收集; 8. 再次平衡:待记录仪基线恢复到零后，用0.02mol/L NH4Ac流洗1-2个柱体积 蛋白质等电点的测定/view/e45875c