NO3-胁迫下菠菜SSH文库构建EST的分析.pdfVIP

园艺学报201l，38(增刊)：2552 http：／／Ⅵn)眦alas．ac．cn Sinica ActaHorticulturae 26．com E-mail：yuanyixuebao@1 徐慧妮+，何小钊，王 康，陈丽梅，李昆志 (昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明650224) 土壤次生盐渍化是设施蔬菜生长的主要障碍因子，设施土壤的盐分组成特点为阴离子主要是 oleracea L．)在我 N03’，约占阴离子总量的67％～76％，阳离子主要是Ca2+和K+。菠菜(Spinacia 国南北方的设施中广泛种植，是典犁的喜硝蔬菜，也是耐盐性较强的蔬菜。为了解蔬菜对N03-胁迫 达序列标签(EST)进行分析，为从分子水平揭示土壤次生盐渍化对蔬菜的伤害机制，解决土壤次 生盐渍化问题提供理论依据。 供试材料为‘益农菠菜’。将菠菜种子按常规方法浸种催芽，两片子叶展平后，转入营养液槽中 培养，待植株长到六叶时进行胁迫处理。对照营养液中NOr为10mmol·L．I，NOr胁迫处理浓度为 100 处理0rain、10rnin、0．5h、lh、3h、6h、24 h后取样，液氮速冻，保存于一8012。RNA的提取 采用Trizol 100 PCR．Select刑eDNA mmol·L。N03处理不同时间后的菠菜根系为检验方(tester)，根据Clotech Subtraction cDNA文库。通过PCR扩增文库中每个克隆的插入片段，分析 大肠杆菌后挑选阳性克隆组成SSH 克隆插入片段的有无及片段的大小，进而判断所构建文库的质量是否符合要求。对文库中插入片段 在200～l500 的可能功能。对部分基因进行RT-PCR分析验证文库的可靠性。 rRNA 从菠菜根系提取的总RNA经1％甲醛琼脂糖变性凝胶电泳检测，出现清晰的28S和18S 两条带，说明总RNA结构完整、未降解，完全可以满足eDNA文库的构建。菠菜cDNA第一链的 000 产物检测结果警弥散状，大小主要集中在500～2bp之间，符合建库要求。本研究共挑取了798 个阳性克隆组成SSHeDNA文库。用PCR扩增检测文库中各克隆插入eDNA的大小，结果显示， 500 插入cDNA片段的长度在200～1 bp之间，平均值约为500bp。挑选260个克隆进行测序，一 共获得2l1个有效的EST。对EST进行BlastX比对及功能注释，发现已知的基因参与到代谢、细 胞救援及防御、细胞转运、信号转导、蛋白合成、DNA和RNA代谢、转录、细胞骨架等途径，说 明菠菜对NOr胁迫应答的复杂性。随机挑选11个基因进行半定量RT-PCR分析，结果表明所选的 l1个基因在NOr胁迫后均上调表达，说明该文库的可靠性。 关键词：菠菜：NOr胁迫；SSH：RT-PCR 中圈分类号：S636．1 文献标识码：A 文章编号：0513—353X(2011)S．2552．ol 收稿日期：201I一∞一2l 基金质目l云南省戍用基础研究面}：项目(2010ZC053) 1581834 ‘E-·m丑iI：haxusml@gmaiteom：Tel：1591