金门高粱酒酿造副产物黄水的抗酪氨酸酶性质研究.doc

金门高粱酒酿造副产物黄水的性质研究 * （厦门大学 生命科学学院滨海湿地生态系统教育部重点实验室，福建 厦门 361 摘要：130，178，104，301，230 ng/mL．5种黄水对蘑菇酪氨酸酶二酚酶均表现为可逆的抑制作用，其中金选、红梗、红糯表现为混合性抑制，两糯和兴湘表现为非竞争性抑制。探讨了5种黄水对小鼠黑色素瘤细胞B16的细胞增殖率、酪氨酸酶活力和黑色素含量的变化的影响。5种黄水对细胞的增殖没有影响，100 mg/mL的两糯和兴湘对酪氨酸酶活力的抑制效果较好，抑制率分别为52.7%和40.9%，黑色素含量的抑制率分别为44.5%和46.1%。综上所述，黄水不仅对酪氨酸酶有很好的抑制作用，还可以很好的抑制黑色素的生成，具有很好的应用前景。 关键词： 中图分类号：Q 356.1 文献标志码：A 酒醅在发酵过程中，淀粉由糖变酒，同时产生，单位酒醅的重量相对减少，结晶水游离出来，原料中的单宁、色素、可溶性淀粉、酵母自溶物、还原糖等溶于水中，并沉积于窖池底部而形成黄水[1]．正常情况下，生产10酒，大约产生3~4黄水，作为白酒酿造过程中的副产物之一，其BOD5），CODcr）含量相当高，远超过国家环保排放标准[]．而黄水中含有丰富的有机酸、酒精，还有淀粉、糖分和微生物菌体及活细胞等，黄水中的许多物质对提高白酒质量，增加白酒香气，改善白酒风味有着重要的作用若采取恰当的措施使黄水中的有效成分得到利用，则可变废为宝 近年来，关于对黄水资源的再利用开展了大量研究，主要包括利用黄水灌窖、养窖、培养人工窖泥[4]，勾兑白酒[5]，酿醋[6]，制备乙酸乙酯[7]，利用黄水中的乳酸制备乳酸钙、合成复合有机酸钙[8]等．徐传鸿等[9]对黄水进行常规的成分分析，发现其中含有0.13%~0.23%的单宁，而Chai等[10]报道单宁物质具有抗酪氨酸酶的作用．我们对金门高粱酒酿造副产物黄水的成分进行了分析，同时探讨了其对酪氨酸酶活性的抑制作用及对小鼠黑色素瘤细胞B16产生黑色素的影响． 材料与方法 材料 L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）购自Sigma公司 方法 采取新鲜酿造黄水，25 ℃培养24 h，将可发酵物分解后，待酒精度不再增加，真空抽取以去除酒精，0.45 μm膜过滤后，真空浓缩，冷冻干燥待用． 黄水的成分分析 淀粉及糖测定采用斐林试剂[11]，蛋白质以总氮分析仪测定，总固形物采用质量测定法。用二甲基甲酰胺溶液振荡提取单宁，过滤后取滤液，在氨存在的条件下，与柠檬酸铁铵形成棕色络合物，用分光光度计在525 nm波长处测定其吸光度值，与标准系列比较定量[12]．取黄水200 mL，经蒸馏后，取100 mL以酒精计测定酒精。 参考文献[13]方法，先加入0.1 mL含不同浓度的于比色杯中，再加2.8 mL预先在30 恒温水浴保温的底物溶液然后加入0.1 mL酪氨酸酶水溶液，即刻充分混匀，在30 恒温条件下检测波长为475 nm的度值随的增长直线，从直线的斜率计算出酶的活力产物的消光系数3700 L/(mol·cm)计算．抑制作用机理是通过Line weaver-Burk双倒数作图，比较酶催化反应的动力学参数，包括表观米氏常数(Km)和最大反应速度(Vm)的变化来判断． 参照文献[14]的方法，采用RPMI 1640培养基，在CO2孵箱培养细胞。待细胞生长至近融合状态，经胰蛋白酶消化收集并调整细胞浓度，在96孔细胞培养板中加入小鼠B16黑素瘤细胞单细胞悬液，每孔180 μL，培养过夜，待细胞完全贴壁后，加入20 μL含黄水的培养液，继续培养72 h，于结束前4 h，弃培养液，用pH 7.4磷酸盐缓冲液洗涤，加入10 μL噻唑蓝（MTT）和90 μL RPMI 1640培养液，在CO2孵箱培养细胞4 h后，弃上清液，加入200 μL二甲亚砜（DMSO），在37 ℃条件下震荡，使甲替结晶完全溶解。立即于酶标仪测定570 nm吸光度值． 同上细胞培养，培养72 h后弃培养液，用PBS缓冲液洗涤，加入体积分数为1% TritonX-100的PBS缓冲液 90 μL，然后加入10 μL 1.0 mg/mL L-DOPA，置 30 ℃ 反应30 min，测定475 nm吸光度值．相对酪氨酸酶剩余活力的计算为：． 待细胞生长至近融合状态，经胰蛋白酶消化收集并调整细胞浓度，接种过夜，待贴壁后换液，加入新鲜培养液和含不同浓度效应物的培养液，继续培养72 h后弃培养液，用PBS缓冲液洗涤，加入DMSO的 NaOH溶液，80 ℃ 2 h，12000 rpm离心10 min，上清液分别用于蛋白质浓度测定和405 nm处吸光度值的测定．相对黑色素含量的计算为：． 结果 黄水的成分分析 测定种高粱在酿酒过程中产生的黄水的成分，