抗伏马菌素B1单链抗体的制备及其免疫学检测初步应用研究.pdfVIP

摘要 摘要 伏马菌素(Fumonisins)是由串珠镰刀菌属产生的常见于玉米等谷物中的一 类真菌毒素，具有神经毒性、肝肾毒性及潜在的致癌性，伏马菌素Bl(FBl) 是最主要污染组分，也是毒性最强的。建立食品中伏马菌素污染残留的有效监 控和检测方法是防止其造成食品安全问题的重要手段。目前，FBl的检测方法 有高校液相色谱分析、液相色谱．质谱联用技术、免疫学分析和电化学分析等， 其中免疫学方法以其简单快速、灵敏、高通量等特点显示出独特的优势。单链 variable 抗体(Single．chainfragment，scFv)是单克隆抗体(Monoelonalantibody, McAb)完整抗原结合特性的最小功能单位，其相对于单克隆抗体具有易于遗传 改造和表达等优点，且有利于生物合成酶标记抗体和发展多种免疫学检测模式。 本研究制备了抗FB。单克隆抗体和单链抗体，基于特异性单链抗体建立了玉米 immunosorbent assay，ELISA)检测 中FBl的酶联免疫吸附试验(Enzyme．1inked 方法。主要研究结果如下： 1分别制备了戊二醛交联法和碳化二亚胺缩合法合成的FBl免疫抗原，即 抗血清，且两组小鼠抗血清在效价和特异性方面未发现明显差异，均未见与FB2 有高交叉反应率。将FBI．GA．KLH免疫的小鼠脾脏细胞与骨瑟瘤细胞进行细胞 融合，经ELISA筛选和亚克隆后获得两株分泌抗FBl单克隆抗体的细胞株， l。 命名为1D1l和3FI 2采用鼠源抗体可变区简并引物从杂交瘤细胞总RNA中扩增获得两株单 克隆抗体可变区片段后，采用重叠延伸PCR将其与弹性连接肽组装成单链抗体 鉴定。测序后，对单链抗体的氨基酸序列进行比对、理化性质分析和同源建模， 结果表明展示在噬菌体表面盼随株单链抗体均具有抗体活性，其序列与鼠源抗 kDa， 体可变区具有高同源性，均能形成正确的空间构象，理论分子量约为25．26 理论等电点为中性或偏碱性，为亲水性蛋白。 3以克隆1D1l为研究对象，构建了单链抗体及其碱性磷酸酶融合蛋白 (scFv．AP)原核表达载体，优化了原核表达条件，单链抗体及其融合蛋白均主 要以包涵体形式存在于细胞质中；对包涵体蛋白进行了纯化与复性后，单链抗 U 摘要 体蛋白具有与亲本单克隆抗体相似的抗体活性，基于seFv的间接竞争ELISA 线性拟合范围是2．10．76．45¨gL。(R2=0．9922)，IC50值为12．67lagL～，与FB2 交叉反应率为5．23％。seFv．AP融合蛋白具有抗体和碱性磷酸酶双活性，但其 碱性磷酸酶活性较低而无法应用于建立检测体系。 4通过ELISA分析表明该单链抗体对温度较敏感，热处理会导致其发生不 可逆失活，65℃处理10mill便可使其完全失活；通过圆二色谱分析发现抗体 的失活是因其二级结构破坏所导致的。间接竞争ELISA结果表明甲醇的存在会 降低单链抗体的ELISA检测体系的灵敏度。基于该单链抗体建立了玉米中FB， 为8．32kg-1，样品加标回收率为86．74．105．41％，变异系数为9．72．11．62％， lag 30份玉米污染样品的ELISA检测结果与高效液相色谱法的检测结果具有较好 的相关性(R2=o．969)。 关键词：伏马菌素；单克隆抗体；单链抗体；原核表达；酶联免疫吸附试验； 稳定性；玉米 Abstract ABSTRACT Fumonisinsarea of metabolites secondaryfungal primarilyproducedby