副溶血弧菌tlh基因缺失株的构建.pdfVIP

第 29卷第 1期 上 海 交 通 大 学 学报 (农 业 科 学版) V0l_29No．1 2011年 2月 JOURNALOFSHANGHAIJIAOTONGUNIVERSITY (AGRICULTURALSCIENCE) Feb．2011 文章编号：1671—9964(2011)010010—06 DOI：i0．3969／J．ISSN．1671—9964．2011 ． O1．002 副溶血弧菌 tlh基因缺失株的构建 赵永刚 ，唐小千 ，战文斌 (1．中国海洋大学 教育部海水养殖重点实验室，青岛 266003；2．中国动物卫生与流行病学中心，青岛 266032) 摘 要：副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticuss，VP)是我国海水养殖鱼、虾、贝类的重要病原，其 主要致病因子热不稳定性溶血素(thermolabilehemolysin，TLH)的功能和致病性仍不十分清楚。 本研究利用PCR技术从VP临床分离株的基因组DNA 中扩增 出tlh基因，利用同源重组技术 ，构 建了副溶血弧茵 tlh基因打靶载体 ；利用PCR方法筛选 tlh基因缺失株，并在卵磷脂存在条件下进 行溶血性检测，结果在 5 兔血平板上能够引起溶血，5 的马血琼脂平板未出现溶血现象，说明 tlh基因敲除成功。本研究成功构建了副溶血弧茵tlh基因缺失株，为进一步研究tlh基因致病性 和溶血机制提供 了必要的实验菌株，为副溶血弧菌其他基 因的敲除提供 了可行性依据。 关键词 ：副溶血弧茵；tlh基 因；同源重组；基 因敲除；溶血活性 中图分类号 ：R378．3 文献标识码：A ConstructionoftlhGeneDeletedMutantofVibrioparahaemolyticus ZHAOYong—gang ，TANGXiao—qian ，ZHAN Wen—bin (1．KeyLaboratoryofMariculture，MinistryofEducation，OceanUniversityofChina，Qingdao266003，China； 2．ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter，Qingdao266032，China) Abstract：Vibrioparahaemolyticus (VP)islistedasoneofthepathogenicvibriosendangeringnet-cage culturedPseudosciaenacrocea，Fennerpenaeuschinensis，and shellfish in coastalareasofChina．TLH (thermolabilehemolysin)isoneofmajorvirulencefactorsproducedbyVP．Theinformationregardingthe biologicalfunctionandnosogenesisremainscompletelylacking．Inthisstudy，weclonedtlhgenefrom the genomeDNA ofVPbypolymerasechainreaction (PCR)．Targetingvectoroftlhgenewasconstructedby homologousrecombinationandgenedeletionmutantwasidentifiedbyPCR．Hemolysisoftlhgenedeleted mutantwasseparatelyidentifiedon5 rabbitbloodagarplateand5 horsebloodagarplate，Thetlhgene deletedmutantintheadditionofphmphatidyehd