pET15bpep1p27mt的构建表达及意义.pdfVIP

维普资讯 药 物 生 物 技 术 PharmaceuticalBiotechnology 2005，12(5)：285~ 290 285 pET15b—pep一1一p27mt的构建、表达及意义 王立林 ，严世荣 ，汪炳华 ，王家宁 ，黄永章 (1．武汉大学医学院，湖北 武汉 430000~2．郧阳医学院附属人民医院，湖北 十堰 442000) 摘 要 构建细胞穿膜肽(cellpenetratingpeptides，CPPs)PEP-1和细胞周期抑制蛋 白p27mt的重组体，并 在大肠杆菌中表达。将已构建的表达细胞周期抑制蛋白p27mt的基因，克隆入 pET15b-pep-1原核表达载体，在 大肠杆菌Bl21(DE3)LysS内，以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用 SDS及Westernblot分析鉴定。 结果：成功地构建 PEP-1p27mt融合蛋白原核表达载体 ，并在 IPTG诱导下获得特异性的表达。PEP-1一p27mt 融合蛋白表达载体的构建，为体内应用细胞周期抑制蛋白诱导肿瘤细胞凋亡提供了理论基础。 关键词 细胞穿膜肽；PEP1；PEP1-p27mt融合蛋 白；pET15b-pep-1一p27mt~重组表达子；抑癌基因 中图分类号 {Q786 文献标识码：A 文章编号：1005-8915(2005)05一O285一O6 由于细胞膜的脂质双分子层结构，生物大分子 的增殖 5【]。作为一个含 198个氨基酸 27ku大小 不能 自由进人细胞，给很多疾病 的治疗带来困难 。 的蛋白质，p27mt很难穿透脂质双分子的细胞膜并 细胞穿膜肽 (cell—penetratingpeptides，CPPs)]是 在细胞 内达到一定的浓度 。本研究构建 pET15b— 一 类能携带大分子物质进入细胞的短肽，该途径不 pep一1一p27mt融合蛋白重组表达子，转化大肠特 依赖经典的胞吞作用，也有研究者称这类短肽为蛋 菌，利用煮沸法粗提PEP-1-p27mt融合蛋白，进行 白转导域 (proteintransductiondomain，PTD)_2， 了SD PAGE分析和 Westernblot鉴定，为大分 或TrojanhorsepeptidesL3j。细胞穿膜肽有天然存 子蛋 白物质进入细胞提供有效的载体，为基因治疗 在和人工合成两大类，Morris小组设计合成了有 3 肿瘤提供了一个新的有力的工具。 个部分组成的21个氨基酸残基的兼性肽段 PEP一1 1 材料和方法 (KETwwETwWTEWSQPKKKRKV)[43，包 括 一 个富含疏水性色氨酸基序的片段(KETwWET— 1．1 材料 wWTEW)，一个间隔区 (SQP)，一个富含亲水性 1．1．1 目的基 因 pORF9一hp27mtv21质粒购 自 赖氨酸基序的区域 (KKKRKV)。这种 CPPs不同 Invivogen公司，由湖北省十堰市人 民医院消化 内 于天然CPPs，它们无需共价键与 目的大分子相连 科徐少勇教授惠赠 。 即可发挥转运外源大分子的作用 。Morris直接把 1．1．2 菌株及质粒 pGEM—TEasy载体系统为 PEP一1与目的蛋白(GFP，~-ga1)混匀加人细胞培养 Promega公司产品；质粒 pET15b、大肠杆菌BL21 液中，发现有 PEP-1存在时天然构像蛋 白也能高 (DE3)LysS购 自Novagen公司，大肠杆菌 DH5a 效进人细胞[4]，这大大改善 以往 的CPPs只能高效 为湖北省十堰市人 民医院临床医学研究所存。 转运变性蛋 白的缺憾 。 1．1．3 试剂 IPTG、