UTR载体引物设计流程.pdfVIP

UTR 报告载体构建引物 一、 设计引物原则 （采用 Primer Premier 5 设计） (1)长度：20—35bp，总的说来，决定引物退火温度 （Tm 值）最重要的因素就是引物的长度。 (2)G 十 C 含量：应在45 ％一55％之间，PCR 扩增中的复性温度一般是较低 Tm 值引物的 Tm 值减去5— 10度。 (3)碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续 G 或 C，否 则会使引物在 G 十 C 富集序列区错误引发。 (4)引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。 (5)引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。 (6)特异性：与非特异扩增序列的同源性应小于70 ％，少于连续8个的互补碱基。 (7)引物的3’端：引物的3’端很大程度上影响酶的延伸效应，3’端不应发生错配。引物的3’端碱基最好选用 G、C， 而尽可能地避免选用 T，尤应避免连续出现2个以上的 T。 二、 序列查找 根据合同中提供了的信息，在 NCBI 上进行比对查找，确认 Gene Name、Gene ID 等信息 １、合同提供了目标序列，用所提供的序列进行查找、确认即可 如：客户提供了以下序列, Mus musculus caspase 3 (Casp3), mRNA NCBI Reference Sequence: NM_009810.2 GenBank Graphics gi|118129865:898-1466 Mus musculus caspase 3 (Casp3), mRNA AGGAATGATTGGGGGTGGGGGGGGGCGTGTTTCTGTTTTGTTATGCCAAATGAGAAAGCTGTCAGGGAGA CTCTCATTTAAATCTAATCTGACGGTCCTCCTGGTCTTTGTACGCTACCACTGCCTAGCAATGCAGCCAG CCACAGTGCAGCTACCTCAACTTCGACATCAGGTAGTTGAAATGAAATTTAATTTAATAAGGAGCAAGTA ACTGTCAATGATGGTACTATCATCCTAGATGAAATTACAAAGTTGCCCTTTTATAATTAGCAAGATTTGG CGATACTATGAATTTTGAAGTCATTTTGAAGCAGTACAGCTTTTCCACTGATGATTTTATACTCCCCACT CATGTTAAGAATGTTGTTCTAGTTTTCGTTAAACGTAGAAACAATAATGTCAAATGATAATGTCTTAGAA CTTGAATCCATGAGCAGAGTCAAAGGCTGGAACCCTTGTTTTGGACCTGATTTATGGAAGTGAAGAGTTG GACCACCATAGCATGCATTATAGCTACTGGTTTTGTGACAGTTGTCCACAACACGTATTTGTTATTTTAA AAAAAAAAA 复制以上序列至ＮＣＢＩ－blast 网址： /Blast.cgi?PROGRAM=blastnBLAST_PROGRAMS=megaBlastPAGE_TYPE=BlastSearc hSHOW_DEFAULTS=onLINK_LOC=blasthome 序列输入位置 选择对应物种 点击此按钮，显示 blast 结果