基于rDNA序列的酵母整合载体的构建及应用.pdfVIP

中国医药生物技术2011年10月第6卷第5期 DOI：10．3969／crnba．j．issn．1673—713X．2011．05．003 ·论著· 基于rDNA序列的酵母整合载体的 构建及应用 支晓慧，王丽娜，朱平，王伟，孔建强 【摘要】 象，稳定性较差。Y1P型载体不含酵母复制子，因 目的构建一个基于rDNA序列的酵母整合载体。 此，不能在酵母中单独存活，必须整合到酵母基因 组上才能发挥功能川。这类整合载体在酵母中的整 方法通过PCR扩增得到酿酒酵母rDNA序列；通过常 规分子生物学技术构建以rDNA序列为整合位点的酵母整 合是高特异性的，很稳定，因此，在以酿酒酵母为 合载体。为了确证该载体的效能，将青蒿紫穗槐．4，1I-二烯 宿主菌的天然产物合成生物学研究中，酿酒酵母整 合酶基冈克隆到该载体七，构建了含紫穗槐．4，II一二烯合酶 合体型载体得到了广泛地应用12川。但由于整合体型 基因的整合型酿洒酵母工程菌。提取该T程酵母的基因组， 载体拷贝数较低，致使目的基因的表达水平不高， 通过紫穗槐．4，II-二烯合酶基因的特异引物进行扩增，确认 目的产物含量达不到工业化生产的水平13j。因此， 紫穗槐．4，ll一二烯合酶基冈是否已整合到酵母基因组h。发 构建一些高拷贝的整合体型载体对于天然产物合 酵酵母工程菌，对发酵产物进行GC．MS检测，确认是否 成生物学的研究显得十分必要。 DNA，rDNA)序列 产生紫穗槐．4。11．二烯。 核糖体DNA(ribosomal 是指细胞核中编码核糖体RNA的DNA序列，它 结果构建了1个酵母整合载体，具有如下特点：①能将 是一段高度重复序列，其重复单位由转录区段和非 外源基冈表达盒序列整合到酿酒酵母rDNA序列上，增加 目的基因的拷贝数：②选择标记能反复应用，方便获得多拷 转录区段组成。在酿、洒酵母的XII染色体中，rDNA 存在100。140个重复单位【5J。如果以酿酒酵母 贝的整合形式：③整合片段不需要酶切线性化，节省了内切 rDNA序列为整合位点，从理论上说，刈‘以得到 酶，而且简化了操作程序。酵母基因组PCR结果表明，紫 100～140个目的基凶拷贝数。因此。本实验基于 穗槐．4，11．二烯合酶基因已经整合到了酵母基因组上。以朱 rDNA序列，构建了一个以rDNA序列为整合位点 栾倍半萜为标准品，对该酿酒酵母工程菌的代谢产物进行 的酿酒酵母整合体型载体，并通过该载体，将青蒿 GC．MS检测，发现其能产生紫穗槐．4，ll一二烯，产量达到 紫穗槐一4，11．二烯合酶基因整合到酿酒酵母rDNA (91．33 4-7．57)mg／t．朱栾倍半萜当量。 序列上。GC—MS结果表明，该工程菌确实能产生 结论初步成功构建了一个基于rDNA序列的酵母整合载 紫穗槐．4，ll一二烯，表明紫穗槐一4，1l一二烯合酶基因 体。 已经整合到了酿酒酵母上。 【关键词】酵母菌，酿酒：DNA。核糖体；遗传载 体； 紫穗槐_4。11．■烯合酶 1材料与方法 www．cmbp．net．cn 中国压药生物技