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第八章 动物细胞培养获得的产品及生产过程 8.1历史 尽管很多研究者很早以前曾经研究在试管中培养的动物细胞的性质，最早将这类细胞应用于实际生产的是J.F.Eeders，他在1949年发表文献，说明脊髓灰质炎病毒可以在灵长类的神经组织或其它组织中生长。 导致这一开创性成果的出现可以简要概括如下。早在1880年，Annold发现白细胞可以在体外分裂，随后又有人发现，动物离体组织在浸泡在血清、淋巴或腹水等组织液中可以生长。通过R.Harrison发明的悬滴培养法是一个转折点，其方法是将蝌蚪脊髓放入特殊的中空的载玻片，里面装入淋巴液，上面用盖玻片封住。Correl又对这项工作进行拓展，他发展出一种巧妙的方法，可以使培养细胞保持不受外来杂菌的污染，这在当时很少有人能够做到。再后来，培养基中加入促进细胞生长的物质，到了1928年，能够在试管中培养的鸡胚或小鼠的碎组织中使病毒生长，这些方法被Enders借鉴，他和他的同事在培养过程中使用了刚刚在10年前发明的抗生素，这对他的试验大有帮助。在20世纪50年代初期，Salk通过滚管培养猴肾组织或睾丸组织的方法制成了脊髓灰质炎病毒疫苗。这种方法建立起来以后，其它疫苗也通过鸡胚或灵长类胚细胞生产。 8.2 从动物培养细胞中获得产品的类型 动物病毒至今仍然是从动物细胞培养中获得的最多的商业产品。目前，每年大约生产1.5×109剂量的口蹄疫病毒疫苗，针对家禽新城病和马克莱氏病的疫苗数量与之相当。人类病毒疫苗每年的投药量每年不超过108剂量。生产干扰素的方法仍然处于发展中，将来会接近或超过动物疫苗的规模，但是现在而言，从特殊合成的杂交瘤中提取的免疫生物制剂仍然是人们不熟悉的领域，然而，这方面无疑将是未来十年会取得重要进展的领域。 8.3产品获得的方法综述 从动物细胞培养物中获得产品的基本路线已经在图中列出。基本上有三个时期组成。第一个时期是准备期，第二个时期涉及到动物细胞的培养。第三个时期是产品获得。最后一个时期在有些产品的生产中并不涉及细胞的分离，而其它产品可能还要用病毒感染细胞或者加入诱导剂。 在生产过程中，人们做了很多努力来控制各种成分的质量，现在许多产品的生产过程中的参数可以在线或者离线监控。质量监控的目的是，确保培养基中所加入的物质可以促进细胞的生长，而且不会污染细胞培养物。 培养基的配制是相当费力的，并且需要技术熟练。许对确定的物质相对来说比较容易控制，然而水和血清这两种组分并不容易控制。水可以有广泛的获得来源，但是即使通过蒸馏和去离子之后，水中仍然可能含有对细胞生长有害的物质。由于这个原因，将格陵兰冰河深层中冰块的融化水作为对照是有好处的。储存准备好的水也是很困难的，因为蒸馏水在室温下可以产生大量的细菌，它们对细胞的生长是有害的。这可以通过我们将准备好的水放在80摄氏度下保存，在该温度下通常认为蒸馏水是无菌的。 通过处理将抗体出去的血清在细胞培养中是非常有用的，可以避免抗体对病毒的影响。但是，购买和检测血清的费用是高昂的，因此可以在实验室中生产。对血清质量的完全控制是试验可重复的重要因素。一般将血清置于－20摄氏度的环境下，避免血清变质。小牛血清在细胞培养中是比较常用的，但是它比较稀少和昂贵。并且其中有可能含有支原体和噬菌体的污染。 动物细胞可以通过两种基本的方式进行培养。大多数的动物细胞，当它们碰到固体培养基或其它固体表面时，这种环境可以诱导它们进行分类。还有一些细胞，可以在液体中悬浮生长。前者被称为单层细胞，因为尽管在连续培养的条件下它们可以形成几层细胞，但是通常它们只能形成一层细胞。不用通过固体培养基的细胞称为悬浮细胞。 一般认为只能进行单层生长的细胞内原癌基因较少，而悬浮细胞中较多，因此，悬浮细胞一般不用于人类免疫制品。很多时候表明，单层细胞与悬浮细胞相比，可以生产更多类型的病毒。然而，一旦病毒可以通过悬浮细胞获得，大规模的生产将更加容易。兽用产品多通过该方法来获得，例如α－干扰素就是通过杂交瘤生产的免疫生物制剂。尽管用于后两种制品的细胞在检测中被证明具有致癌性，但是在生产过程中或者在使用过程中也不具有危险性，因为在使用之前，会把细胞出去。 8.4单层细胞生长系统 培养细胞系统所需的培养基可以分为两种类型。增加设备数量可以扩大处理规模。获得细胞需要多个处理步骤，通过增加设备的规模，也可以扩大处理的规模。 8.4.1单层细胞培养的多步处理 通常，可以在静止玻璃瓶中或培养皿中生产单层细胞。这些瓶子具有不同的结构，分别以以Brockway，Rorx，Carrel，Baxter或医用flat命名。这些瓶子可以使用苏打玻璃，但是最好使用硅硼玻璃，因为尽管后者价格较高，但是硅硼玻璃较为结实并且易于修补。这些瓶子可以单独使用，但是为了运输方便，它们通常堆放在瓶架上。 固定瓶培养系统已经有了一些发展