毛细管电泳分离技术.pptVIP

第三章　毛细管电泳分离技术 第一节　概　述 电泳是基于两种或多种带电粒子或微粒，它们所在的介质受到外加直流电场的作用下，其迁移速率不同而得到分离的一类方法。（electrophoresis ） 发展历程 1807年，Ferdinand Frederic Reuss就观察到了荷电物质在电场力作用下会发生运动的现象。 1909年，由Michaelis对此现象的描述中提出电泳这个术语(elektron和pbore,分别代表电和搬运者的意思 ) 20世纪30年代，通过Tiselius的研究，电泳技术才得到有实际意义的发展，Tiseluis也因此获得了1948年度的诺贝尔奖。 到20世纪50年代，电泳已经是一种与纸和薄层的平面色谱技术一样的实验室常用技术。 20世纪70年代在HPLC的推动下，电泳分离技术成为了一种“灰姑娘”式的技术 1981年，Jorgenson等介绍了毛细管区带电泳技术。 1984年Terabe等提出的胶束电动毛细管色谱。 1987年，Hjerten建立了毛细管等电聚焦。 1987年，由Chohen等提出了毛细管凝胶电泳。 1991年，Monnig等首次提出了高速毛细管电泳。 目前，毛细管电泳已广泛应用于氨基酸、肽、蛋白质和核酸等离子型生物大分子的分离分析，加入表面活性剂还可以扩大到中性粒子，甚至应用到细胞和病毒等的分离。同时，在小分子化合物的分离分析方面也取得了重大进展。 第二节　毛细管电泳基本原理 一、毛细管电泳的理论基础 毛细管电泳法：是指以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分的淌度（单位电场强度下的迁移速度）和/或分配行为的差异而实现分离的一种分析方法。 在毛细管电泳中带电粒子所受的驱动力： 电泳力 电渗力 （一）电泳和电渗 电泳(Electrophoresis)是指溶液中带电粒子(离 子、胶团)在电场中定向移动的现象。电泳是驱动电 解质运动的第一种动力。 电泳迁移速度Ve : Ve= μeE = μeV/L 注：μe:电泳迁移率(电泳淌度); E:电场强度; V－毛细管柱两 端施加的电压；L－毛细管柱的长度。 μe =νe/E= Q/f 当毛细管长度一定时，带电离子的迁移速度 与溶质离子的电荷、施加的电压、缓冲溶液 的粘度及带电离子的大小有关。 电渗(Electro osmosis)是驱动电解质运动的第二种作用力，它使毛细管中的溶剂在直流电场作用下发生定向运动。 电渗流的产生 毛细管内壁表面上的硅醇基在pH3的水溶液中，可电离而产生SiO-负离子，使毛细管内壁带上负电荷，因此，溶液中的一部分正离子就靠静电作用而吸附于毛细管内壁上，形成一个双电层(Electric double layer)。其中一层是带负电的内壁，一层是带正电的溶液离子吸附层。但溶液中的其余大部分正离子则是离内壁越远，越呈自由状态，于是在吸附层之外又存在着一个扩散层 。 固、液两相之间的相对运动发生在吸附层与扩散层之间的滑动面上，此处的电动势称为界面电动势，也称ζ电位。 由于处在扩散层中的正离子的溶剂化作用，它在电场中发生迁移时，将带动整个溶液向阴极移动，所以就形成电渗流（Electro Osmotic Flow, EOF）。 电渗流速度Veo与ζ电位、ε、E成正比，而与介质的粘度η成反比。 电渗流的意义 电泳过程中伴随着电渗现象 电渗流的速度比电泳速度快5-7倍 利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向，产生差速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析。 电解质区带的移动速度(Vi)等于电解质区带的电泳迁移速度(Ve)与溶剂流速度(Veo)之和。 当把样品从阳极端注入毛细管时，假设A物质为负离子，B物质为正离子，则带不同电荷的离子将按下面的速度迁移到阴极，到时间t时，A、B物质已经分离了。 正离子：νt =νeo + ν+ 中性分子：νt = νeo 负离子：νt =νeo - νˉ 抑制毛细管中电渗流的办法： 消除固液界面间的ζ电位或提高溶液的粘度； 在毛细管的内壁涂上聚合物，如聚丙烯酰胺涂层。 具体方法有： (二)分离效率和分离度 1、分离效率 柱效可用理论塔板数n表示 2、分离度 电泳中两峰的分离度，也称分辨率，它表明湍度相 近的组分分开的能力，可表达为（和哪些因素有关）： 分离度计算式（具体如何计算）: （三）区带宽度及展宽因素 1、各组分都有相近的空间宽度 毛细管电泳里有电渗流，泳动是平头的，几乎不扩散，不管什么时间测峰，区带宽度几乎是