MTT法检测食用菌液体菌种活力的研究.pdfVIP

http :// MTT 法检测食用菌液体菌种活力的研究 马浩， 高振江 中国农业大学工学院 E-mail:kingix@21 中文摘要：本文研究了MTT 方法在食用菌液体菌种活力测定方面的工艺条件。结果表明，MTT 溶液的最佳添加量为10％，最佳的染色条件是35℃，3 小时；最佳的色素溶解条件是35℃， 4 小时。梯度稀释浓度吸光度的研究表明，浓度与吸光度值之间线性关系明显，线性方程为 ， 线性显著，相关度高，适合作为检验菌种活力的标准。 关键词： MTT，液体菌种， 活力 1．前言 [1,2] 食用菌液体菌种技术因其具有生产时间短、生物学效率高、接种简单的特点 而逐渐 [3] 的被食用菌生产者采用。然而液体菌种同时又具有老化快，不宜久贮的特点 。液体菌种的 活力会因为生产工艺、贮藏时间等因素的影响而有很大差别。如何界定菌种的活力水平，是 制约液体菌种技术推广的一个瓶颈。 MTT 染色法是今年发展起来的一种细胞浓度和活力测 的方法。原理是首先通过细胞 线粒体内部的琥珀酸脱氢酶（NADH ）催化MTT 生成有色的晶体物质，然后通过有机溶剂 将该物质溶解，再通过比色法测定吸光度值，从而得到相应的细胞活力。1983 年，Mosmann 在研究哺乳动物细胞凋亡时首次采用了MTT 染色法。随后，该方法广泛地应用于动物、植 物、微生物细胞的活力检测方面并取得逐步完善。 [4] 赵承彦，靖志安等的研究 表明，MTT 溶于水性溶剂，也溶于有机溶剂，但是在水中 溶解较好。甲臜不溶于水性溶剂，易溶于有机溶剂，乙醇、丙醇、乙二醇甲醚、DMSO 等都 是较好的溶剂。甲臜溶解后呈蓝紫色，在570nm 处存在吸收波峰。 [5] Stefan I.Liochev 等的研究 表明，MTT 溶解于PBS 溶液，达到5mg/ml 的浓度时染色效 较好。 [6] C.Stentelaire 等在对真菌孢子的MTT 染色研究 中发现，当溶液pH 为5～6 时染色效 较好，这与灰树花液体菌种的pH 接近，孢子染色的合理温度范围是40 ℃～70℃，每毫升孢 7 8 2 子数量在1×10 ～5 ×10 范围内与吸光度有极显著的线性关系 （R ＝0.99 ）。 本研究将采用MTT 作为染色剂，DMSO 作为色素溶解剂，进行灰树花液体菌种的活力 研究。对实际应用中MTT 溶液的用 、染色和色素溶解过程中时间、温度的设定和 MTT 染色吸光度值与菌种活力曲线进行研究。 - 1 - http :// 2．实验材料 2.1 菌种及其制备 母种：灰树花1 号，中国农业大学生物学院食用菌研究所提供。 斜面培养基 （PDA 综合培养基）： 铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%。 铃薯去皮，切成块煮 沸30min，然后用2 层纱布过滤，再加葡萄糖糖及琼脂，加热至琼脂溶化后补足水定容，121 ℃湿热灭菌20min。接种后25℃培养15天，菌丝长满斜面。4℃冰箱贮藏。 一级液体菌种的制备： 一级液体菌种培养基采用综合PDA 去琼脂培养基。母种经斜面活化之后，在超净工作台无菌 2 条件 ，用接种铲取 0.5cm 左右的菌块接种于装有 150ml 一级培养基的500ml 三角瓶中， 每瓶5～7 块，恒温25℃静置2 天，然