一种筛选对虾白斑综合症病毒中和抗体的新方法.pdfVIP

第 26卷 第 3期 水 生 生 物 学 报 Vo1．26．No 3 2002年 5月 ACTA HYDR0Bl0 【DCICA SINE A M盯 ．2 0 0 2 一 种筛选对虾 白斑综合症病毒中和抗体 的新方法 高 宏 袁必锋 袁 丽 赵新颜 戴和平 (中国科学院水生生物研究所 ．武汉 430072) 摘要：用对虾淋巴组织的原代培养细胞与对虾 白斑综合症病毒进行相互作用 ，洗去不能结合 的病毒 ，然后用甲醛固定 ，再用 ELISA法检测所吸附的病毒 当病毒与抗血清保温后 ，抑制病 毒与细胞 的吸附能力的抗血清 中应 含有 中和抗体 。此方法可 以在缺少细胞系的情况下 ，简便 地筛选到中和抗体 。 关键词 ：细胞原代培养 ；对虾 白斑综合症病毒 (WSSV)；中和抗体 中图分类号：$945．4 6 文献标识码 ：A 文章编号：1000-3207(2002)03．0259．05 对虾 白斑综合症病毒 (WhiteSpotS)atdromeVires，WSSV)是一具有囊膜 的双链 DNA病 毒，是造成 自1993年 以来对虾太面积爆发性死亡的主要病原体一1．。另据报道 ，我 国科学 家对该病毒的全 DNA序列已测定完成 ，其部分囊膜蛋 白的结构和功能正在研究之中，但 如何有效地 防治该病毒病 的爆发 ，仍然没有有效 的方法 。 病毒与宿主细胞相互作用机理 的揭示 ，将会为撮终防治 WSSV提供必须 的理论基础 。 中和抗体 ，特别是单 克隆中和抗体是此项研究 的有力工具 。然而对虾细胞系 目前还未成 功建立，这为中和抗体的筛选带来 了很大困难 。在对虾原代细胞培养 的基础上l3J，依据病 毒感染宿主细胞 ，首先是病毒识别蛋 白与一个宿主细胞受体蛋 白的相互作用的原理 ，利用 病毒与宿主细胞亲和吸附这一特性 ，建立 了一个新的筛选 中和抗体 的方法。实验结果表 明，该方法操作简便，数据可靠 ，完全可 以在缺少细胞系的情况下成功地用于筛选 中和抗 体 1 材料 与方法 1．1 试剂 Leibovitz’sL-15培养基购 自美 国 LIFETECHNOLOGIES公 司；胎牛 血清 购 自 Promega公司；人表皮生长因子购 自GIBCO公 司；青霉素、硫酸链霉素购 自BIB公司；能特 异结合 WSSV的单链抗体 A1，为本实验室制备 ；HRP／Anti．ETagconjugate鼠单抗购 自Phar． macia公 司。 1．2 WSSV的分离纯化殛 电镜检测 染病对虾采 自广东油头 。抽取 的对虾血淋 巴液经 冻融后置 于蔗糖密度 梯度 (30％、50％和 6o％)顶 部 ，以 125+000r／nfin，离 心 90rain。在 50％ 收稿 日期 ：2~ 14}9．O1}修订 日期 ：2001．09—29 基金项 目：中国科学院择优特别支持费：Sm98—3．05]；国家 自然科学基金 3~050003H]和[30l7町27 作者简介 ：高蛊 (1971 】，男 ，湖 北省监利县人 ；助理研究员 ；研究方 向为生化及分子生物 学 通讯作者 ：戴和平 Tel：027—876477161E-mall：b @ihb… n 水 生 生 物 学 报 26卷 (w／v)一60％(W ／V)蔗糖密度之 间有一 白色透 明带 ，此 即为 WSSV形成 的沉淀带 ，取此 白 色透 明带 ，用孔径为045pro的 Nc膜过滤除菌 ，分装保存待用 纯化 的病毒滤液用 2％磷 钨酸负染法 ，在 HitachiH一600透射 电镜下观察 。 1．3 抗血清的制备 取 257g纯化的完整病毒与完全弗 氏佐剂混匀，膜 腔注射出生 6个 星期 的雌性 57xDBA杂交小 鼠。以三个星期为 间隔 ，以不完全弗 氏佐剂与 25g纯化病毒 对小 鼠进行三擞腹腔注射。最后一次注射 lOd后 ，心脏取血 ，以 10，000r／min离心 10min， 取上清 ，一20℃保存待用 。 1．4 Dotblot法检测抗血清的特异性 将 2gg对虾血淋 巴液抽提物与2gWSSV分别点 在 NC膜上 ，用 PBSM(PSB+4％脱脂牛奶 )在