实验四 用遗传标记鉴定水稻品种的亲缘关系.docVIP

实验四 用遗传标记鉴定水稻品种的亲缘关系 一、目的 1、了解袁隆平的杂交水稻三系配套和杂种优势利用的基本理论。 2、遗传标记用于水稻三系及杂种F1间亲缘关系的初步鉴定的基本原理 3、初步掌握PCR和琼脂糖凝胶电泳技术 二、原理 1、三系配套、杂种优势和遗传标记用于水稻品种亲缘关系鉴定的基本理论和原理 植物在生长发育过程中，由于受环境条件影响或自身遗传突变导致雄性生殖系统退化不能产生花粉或者产生的花粉缺乏正常的功能，而雌性生殖系统发育正常的一种生物学现象，称为雄性不育。植物雄性不育在自然界普遍存在，据统计，已经在43个科、162 个属、320个种的617个种和种间杂种中发现了雄性不育现象（徐秉芳，2000）。如果雄性不育遗传方式符合孟德尔遗传规律的，称核雄性不育（Genic male sterility，简称GMS）；如果以母性方式遗传，则称之为细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility，简称 CMS）(Kaul, 1988)。 袁隆平的最大贡献在于最早实现生产上大面积应用的杂交水稻三系配套。所谓的杂交水稻三系是指（细胞质）雄性不育系（A表示）、保持系（B表示）和恢复系（R表示），不育系是以细胞质母性方式遗传的，不育基因现在基本确定是线粒体基因。不育系与强恢复系杂交后经人工选择可获得产量、品质和抗病性等均有明显超越亲本性状的杂种F1代，可用于生产应用，这就是杂种优势利用。可是，不育系（A）本身不育，一季后就无法大量保存（可以用稻兜保存），生产上也就无法大面积应用。保持系（B）与不育系杂交则能结种子，而且结的种子在长成植株后又是与原来的不育系完全是一样的，也就是保持系（B）能使不育系大量地繁殖以适合于生产应用。 不育系（A）与保持系（B）的区别基本上是不育系存在不育基因，而保持系不存在不育基因。恢复系（R）与不育系（A）基本上是毫不相关的品种，当然恢复系也是没有不育基因的。不育系的不育基因基本确定是线粒体（细胞质）基因，因而不育系（A）与恢复系（R）杂交后代F1应该含有不育基因，F1长成植株后本身是可育的，主要原因是恢复系提供的细胞核基因能恢复它的育性。 生产上应用的是F1杂交种子，而生产F1杂交种子成本较高，因而商业经营上可能会有人以恢复系（恢复系本身往往是曾经或正在生产上应用的品种，自交收种子就行，成本低）代替。为了大致区分水稻细胞质雄性不育系（A）、保持系（B）、恢复系（R）和杂种F1种子，我们可以根据已知的不育系（A）的不育基因设计引物，分别以A、B、R和F1全基因组DNA为模板，经过PCR和电泳检测，有目的PCR产物带的是不育系A和杂种F1，无目的带的是保持系B和恢复系R，这样就基本上可以将杂种F1与恢复系R初步区分出来。 2、PCR反应原理 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，它是近年发展起来的一种体外扩增特定目的DNA片段的技术。PCR技术实际上是在模板DNA、引物和４种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。反应分3步：①变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。③延伸：在DNA聚合酶和4 种dNTP底物及Mg2+存在的条件下，5→3的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，2-3小时之后，介于两个引物之间的特定目的DNA片段得到了大量复制，数量可达2×106～7拷贝。 3、琼脂糖凝胶电泳检测的基本原理 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。 在pH值为8.0~8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 三、材料 粤泰A、粤泰B、9311（恢复系R）和红莲优6（杂种F1）的全基因组DNA。 四、主要的器具、药品试剂 主要仪器设备：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉 主要药品试剂： PCR反应： 1. 上下游引物: 浓度为各10 pmol/μl。