Bt毒素受体钙黏蛋白的酶联免疫检测方法.pdfVIP

江苏农业科学 2011年第 1期 畅 红，苏建亚．m毒素受体钙黏蛋 白的酶联免疫检测方法[J]．江苏农业科学，2011(1)：135—137 Bt毒素受体钙黏蛋白的酶联免疫检测方法 畅 红，苏建亚 (南京农业大学植物保护学院农药科学系，江苏南京210095) 摘要：报道了3种鳞翅 目昆虫(棉铃虫、斜纹夜蛾 、二化螟)中肠细胞膜上 Bt毒素受体——钙黏蛋白的酶联免疫 (ELISA)检测方法。在这 3种鳞翅 目幼虫中肠 BBMV(brushbordermembranevesicles)粗提液 中，棉铃虫和斜纹夜蛾 的 总蛋 白含量相近，而二化螟中肠BBMV的总蛋 白含量较低，大约为棉铃虫的一半。采用棉铃虫钙黏蛋 白合成多肽的 多克隆抗体对 3种幼虫的BBMV进行了ELISA分析，建立了ELISA检测的方法与条件，当用该抗体检测二化螟幼虫 的BBMV时灵敏度很高 ，其次是斜纹夜蛾与棉铃虫幼虫。 关键词 ：免疫检测方法；钙黏蛋 白；总蛋 白含量 中图分类号：s435．622 ．3 文献标志码：A 文章编号：1002—1302(2011)01—0135—02 转 基 因抗虫棉在世界各 国已种植十几年 ，在我 国也有 1．2 抗体制备 大规模种植，为棉铃虫的防治、减少杀虫剂的使用作出了重要 钙黏蛋 白多克隆抗体 由上海生物工程技术服务有限公司 贡献。但关于害虫对 产生抗药性的风险也备受学者关注， 根据钙黏蛋 白的多肽片段 “623NrrPPrLRLPRsTPSVEENC64O” 田问抗性的检测技术有F 代法、F，代法、诊断剂量法 以及 制备。 DNA分子检测法 。南京农业大学沈晋 良领衔的实验室多年 1．3 BBMV(brushborderIIlembranevesicles)提取 来一直采用F 代法检测华北地区棉铃虫对 棉的抗性状 取幼虫各 1头，用 75％乙醇和无菌水消毒洗净后放入 况 ，认为抗性基因频率在不断上升 。。。吴孔 明领衔 的实验 2mL离心管中，每支离心管加入 500txLBufferA(25mmol／L 室则主要采用诊断剂量法检测，认为棉铃虫对 棉还没有产 Tris，150mmoL／LNaC1，5mmol／LEDTA，pH值7．4)，冰上充分 生抗性 ，美国也还没有产生抗性的报道 。虽然 F 代法 匀浆 (使 昆虫中肠被完全研磨混入缓冲液中)；将匀浆液离心 与F 代法可进行抗性早期预警，但工作量非常大，人们希望 (4℃下 2200g15rain)后取上清液分装于 100 L离心管中 借助分子生物学的方法进行抗性检测，但从已有报道来看，均 做好标记，并用液氮速冻，置于 一20qC下保存，备用。 未检测到田间种群的 抗性 。魏秋学等报道了PCR法检 1．4 BBMV总蛋 白含量测定 测 田间抗性的技术 ，也没有从 田问检测到抗性基 因 。从 已 整虫BBMV粗提液总蛋 白含量采用考马斯亮蓝 R一250 报道的胁抗性机理来看，害虫对 Bt毒素产生的高水平抗性 法 ”测定，以牛血清蛋 白为标准蛋 白制定标准曲线。 均是由毒素受体——钙黏蛋 白发生基因突变所致的 ““，在 1．4．1 标准曲线制作 标准曲线按图1所示在240 L体系 田间棉铃虫种群中可能存在多种类型的钙黏素突变等位基 下测定得出，标准蛋 白溶液浓度为 0．1mg／mL，所加标准蛋 白 因，导致毒素受体缺失，失去 了与 Bt毒素的结合位点，由于突 溶液依次为 8、l6、24、32、40 L，所加蒸馏水依次为 32、24、 变的多样性，采用基因检测法可能存在很大困难 。所 以，笔者 16、8、0IxL，再依次加入 200 L考马斯亮蓝 R一250溶液，反 提出在受体蛋白水平上的检测技术，采用 ELISA方法检测钙 应 2min后放入酶标仪中读数。最后计算得到标准 曲线方程 黏素的变化，探讨该方法用于 抗