大肠杆菌分枝杆菌分泌型穿梭表达质粒pBCGSPHSP65的构建及人结核杆菌HSP65的表达.pdfVIP

卷 期 生 物 工 程 学 报 ! ! %’ (! ) (! 年 月 !# $ !#$%% ’()*$+, (- .#(/%0$(,(12 *+,-. !# !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 大肠杆菌 分枝杆菌分泌型穿梭表达质粒 的 ! #$%!’!(’)* 构建及人结核杆菌(’)* 的表达 戴五星 陈智浩 高 红 黄海浪 梁 靓 程继忠 皇甫永穆 （华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系，武汉 #$$ ） 摘 要 用 技术从 （ ）基因组中扩增出抗原 （ ）的信号肽（ ） 序列，从 EFG 5+-’’?D F+’;8HH8/B?I,A 5FJ 315 4B315 KE L)4 MF*%*7NKE61 质粒中扩增出人结核杆菌NKE61 全长基因。利用 L)4 重组技术将以上两个片段插入质粒 M5FJ/ 的人结核杆菌 启动子下游，构建成分泌型原核穿梭表达质粒（ ）。酶切鉴定、 和测序 !2 NKE0 M5FJ/KE/NKE61 EFG 分析结果均表明分泌型原核穿梭表达质粒 M5FJ/KE/NKE61 构建成功。利用电穿孔将该质粒转入耻垢分枝杆菌 （ ， ）中，用卡那霉素筛选出阳性重组子。经热诱导后用 观察到在耻垢分枝杆菌 320(4+0/%*#+, 5%15+/# *K KLK/E4J: 中61OL 蛋白占总蛋白的! P ，而在重组耻垢分枝杆菌表达的61OL 蛋白占菌体总蛋白的$# Q#6 P ，占裂解物上清总 蛋白的63 Q16 P ，表明重组的NKE61 基因能在耻垢分枝杆菌中高效表达，表达的蛋白大部分以可溶状态存在。通过 R8DH8,A/S’H 证实分泌的该蛋白能与结核杆菌NKE61 的抗体特异性结合，说明该重组蛋白具有NKE61 的生物学活 性。 关键词 信号肽，结核杆菌NKE61，分泌型原核穿梭表达质粒，重组耻垢分枝杆菌 中图分类号 文献标识码 文章编号 （ ） G$03 Q92 4 2/$62 !# !/20/1 结核病是由结核杆菌引起的严重威胁人类健康 到此质粒中，研究其在耻垢分枝杆菌中的表达效率 的头号传染病。现在全世界已有近! 亿人感染结 及生物学活性，为耻垢分枝杆菌的应用和结核病疫 核杆菌，每年新发病人数约2 万，死亡人数约$ 苗的发展提供实验依据。 ［］ 2 万 。随着结核杆菌耐药菌株的持续增加、加之人 + 材料与方法 类免疫缺陷病毒（ ）所致艾滋病的流行，致使 NT% 5FJ 这一传统疫苗的效价降低。据世界各国报道， +, + 菌株与质粒 大肠杆菌 由本室保存， 质 其保护效率为 U 31 P ，平均为1 P 。因此急需研