实验2引物设计与测序结果分析.docVIP

学院：______ 班级:_______ 学号:_________ 姓名:__________ 成绩：______ 实验二 引物设计及测序结果分析 目的： 1、掌握常规引物设计的原则及操作流程。 2、熟悉简并引物设计的原理及操作方法。 3、熟悉引物设计软件及在线引物设计工具的操作方法。 4、掌握使用相关软件及在线工具分析测序结果的方法。 内容： 1、使用Primer Premier、Oligo、BLAST等软件及在线工具进行常规引物设计，并对引物扩增效率、特异性进行评价。 2、使用DNAMAN软件进行常规引物快速设计。 3、使用NCBI中的在线引物设计工具Primer-BLAST快速设计引物。 4、使用在线工具CODEHOP设计简并引物。 5、使用Chromas、BioEdit软件查阅测序结果峰图文件。 6、使用DNAMAN软件对测序序列进行编辑，进行序列拼接。 软硬件要求： 联网计算机，预装Windows 7操作系统，预装IE或Chrome浏览器、英汉电子词典（有道词典或金山词霸），预装DNAMAN7、Primer Premier5、Oligo7、Chromas、BioEdit等生物信息学分析软件。 操作及问题： 一、Primer Premier5、Oligo7、BLAST常规引物设计 本部分操作将使用Primer Premier5、Oligo7、BLAST等软件及工具设计拟南芥AtBADH基因编码区全长特异引物。（参考“第四章引物设计及测序结果分析”课件） （一）使用Primer Premier5搜索引物 1、在NCBI数据中查找登录号为NM_001198470的序列记录，查阅相关信息，并下载序列将其保存为fasta格式文件。 问题1：该序列是什么类型的序列？该序列编码区在什么位置？ 2、打开Primer premier5软件，点击file→new→DNA sequence，使用快捷键ctrl+V将上一步中下载的序列粘贴入弹出的GeneTank窗口中（或者点击file→open→DNA sequence，选择上一步保存的文件并打开）。 3、点击GeneTank窗口中左上角的Primer按钮，在弹出的Primer premier窗口中点击Search，在弹出的Search Criteria窗口中根据要求选择合适选项及参数，选定后，点击OK，如弹出的Search Progress窗口中有OK按钮选项，点击OK，弹出Search Results窗口；如没有出现OK按钮，则改变引物筛选条件及参数重新搜索引物。 4、点击Search Results窗口中某对引物，在Primer premier窗口中查看选中引物的详细信息，初步判断引物质量。 5、点击程序主窗口中Edit→Copy，将选中引物保存在新建文档中，供后续步骤继续分析。 （二）使用Oligo7评价引物 1、打开Oligo7软件，点击File→Open打开基因序列（即NM_001198470），或点击File→New sequence粘贴基因序列，熟悉窗口中各项功能。 2、点击菜单Edit→Forward Primer，将Primer premier5设计的一条上游引物粘入弹出窗口，点击√接受输入，点击Edit→Upper Primer选中该引物作为上游引物。同理点击菜单Edit→Reverse Primer，将Primer premier5设计的一条下游引物粘入弹出窗口，点击√接受输入，点击Edit→Lower Primer选中该引物作为下游引物。 3、依次点击菜单Analyze中的Key Info、Duplex Formation、Hairpin Formation、Composition and Tm、False Priming Sites，查看软件对所选引物对的评价。 4、点击菜单Analyze中的PCR，查看软件对该对引物的PCR反应的归纳。 5、依次将Primer premier5设计的各对引物载入Oligo进行评价，选择合适的引物。如未能发现完全满足要求的引物，可通过在引物末端去掉一个不满意的碱基或加上一个碱基，再对其评价分析是否可用。 （三）使用在线BLAST分析引物特异性 1、打开NCBI BLAST程序页面（/Blast.cgi），点击Basic BLAST下面的nucleotide BLAST，进入新页面。 2、在Enter Query Sequence下面的框内连续输入上游引物、20个以上的N、下游引物的反向互补序列，在Choose Search Set下面Datebase后选择Others，点击下方BLAST按钮开始运行程序。 3、根据BLAST结果分析该对引物的特异性，如果匹配的序列均为该基因的同源基因，则特异性好，如出现其他基因，需根据具