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小鼠胚胎细胞的原代与传代培养及观察 南京师范大学生命科学学院唐嘉艺 摘要：细胞培养是生物学和医学研究最常用的手段之一，可以分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。由于细胞刚从活体组织中分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后的传代培养创造条件。 传代培养是组织培养常规保种方法之一。当细胞在培养在培养瓶中长满之后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代培养要在严格的无菌条件下进行。 本次实验主要是为了培养能独立进行细胞的原代和传代培养的能力，熟练掌握进行细胞原代与传代培养的条件、实验材料、方法等。 关键词：小鼠胚胎 原代培养 传代培养 无菌 前言：在体外培养中，有三个培养层次，即细胞培养、组织培养和器官培养。细胞培养是指从体内取出组织，经消化酶消化成单细胞或细胞群，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下使细胞生存和生长并维持其结构和功能的方法。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外生长，必须满足一下的基本要求： 供给细胞存活所必需的营养条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气等。 要有适合各种细胞生长的适宜温度，并注意细胞生长环境的酸碱度与渗透压的调节。 细胞培养必需严格控制在无菌条件下。细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。 培养细胞所用器材及试剂： 设备 超净工作台 滤器 CO2培养箱 电热干燥箱 器械及器皿：培养瓶、培养皿、滴管、镊子、手术剪 培养液：目前常用的基础培养基均已商品化，如RPM1640，MEM，M—199等，可根据培养需求合理选择。 血清：一般常用为小牛血清，人血清和其它动物血清。 平衡盐溶液：主要用于作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压，提供缓冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。常用的有PBS，Hank’s等。 抗生素：常用为青霉素和链霉素。 其它添加成分：缓冲系统，常用为HEPES，在20。C时为7.55，37。C为7.31；HEPES不是起维持PH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速PH变化的，所以调整PH常常用NaHCO3溶液。有机补充物，如丙酮酸钠，谷氨酰胺等。促细胞分裂因子，如生长因子类的FGF，EDF。贴壁和铺展因子，如胶原蛋白，纤粘蛋白等。 细胞培养的基本方法： 组织、细胞的解离方法 解离组织：在无菌情况下采取动物的组织或器官，放在含有抗生素的平衡盐溶液（BSS）中，然后尽快在超净台或无菌室内进行解离处理。 解离时应注意：尽可能将脂肪和坏死组织去除干净；剪碎组织时，避免损伤组织块；解离组织时，避免损伤组织块；解离组织用的各种酶系，需要先进行低速离心。 解离细胞：可用酶和螯合剂进行解离。常用的酶有胰蛋白酶、胶原酶，胰蛋白酶解离所需时间短，主要缺点是会使细胞破损；胶原酶解离细胞方法对解离胚胎性、正常和恶性组织是很有效的。螯合剂解离细胞法的分离效果差。另外还有机械解离细胞法，虽然比酶法所需时间短，但细胞存活率较低。 细胞培养中应注意的几个问题： 培养液和培养物的比例：一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，不嫩盲目增加每单位体积的细胞浓度。 PH：初培养PH应为7.4，培养过程中应不低于7.0。 培养瓶内的空间：一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为1：10。 实验材料： 怀孕母鼠，取鼠胚胎，可在开放实验室内操作。处死后打开腹腔，取出子宫，不打开子宫黏膜，连子宫一同放入培养皿内，放入洁净间。 实验方法及步骤： 1、原代培养 1．1 取材：取怀孕母鼠，颈椎脱臼法处死后，整个鼠体浸入盛有纯酒精的烧杯中浸泡1分钟。取出母鼠在不锈钢手术盘中用无菌手术剪打开腹腔，取出鼠胚，放入无菌培养皿内。注意取材可在无菌操作台外操作。 1.2 用70%酒精擦拭装有鼠胚的培养皿外周后，将培养皿移至超净工作台上，用含双抗的Hanks液洗涤鼠胚数遍去除血污。用无菌手术器械去除头、尾和四肢及内脏，余下组织用剪刀剪碎后，再用含双抗的Hanks液洗涤数次。最后用含血清的细胞培养液清洗。 1.3 把组织块剪成1mm3左右大小于培养液中，用无菌胶头吸管吸取组织块，注意要吸在专用的细胞长吸管前端细长部位，如吸得过高，可使组织小块粘附于管壁而无法吹出。组织块应均匀贴附于细胞培养瓶的底部，注意组织块间要留有空间，不要太密。 1.4 翻转培养瓶，使贴附组织块的细胞培养面朝上，在培养瓶底加入细胞培养液3-5ml，不要加得太多以免培养液漏出产生污染。旋好瓶盖后在培养瓶侧用油性笔写上培养时间。细胞培养瓶放于CO2恒温培养箱中，温度为37℃