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神经逆行示踪法在面神经损伤修复方面的应用 　　 作者：张丽丽 作者单位：山东大学医学院，济南 250012 　　【摘要】 面神经损伤修复后的形态结构重建和功能恢复非常复杂，相关研究的层面和切入点众多，如面神经的逆行示踪染色、病理学、电生理学检查、免疫组化等。在此，我们概述面神经逆行示踪方法的进展，重点综述其研究方法以及常用的示踪剂种类。 　　【关键词】 面神经 神经损伤 再生修复 逆行示踪 　　面神经损伤修复后通常遗留一系列并发症，如联带运动、鳄鱼泪综合征、镫骨肌收缩、面肌挛缩和半面痉挛等，其发生机制是在面神经再生过程中，因轴索生长方向错误或某些轴索的髓鞘再生障碍、相邻轴突短路等导致末梢器官的神经再支配出现紊乱或不完全。神经逆行示踪染色是研究解决此问题的方法之一，现就其原理、实验方法以及常用示踪剂等综述如下。 　　1 原理 　　逆行示踪主要依靠神经纤维的轴浆流将示踪剂从外周神经运输到神经元胞体内。轴浆流作为神经元的一项基本活动，能保持神经元胞体与神经末梢长距离功能联系，运输神经递质、有关酶和其他物质到胞体，是再生神经纤维形态结构和功能恢复的重要活动形式。通过逆行示踪染色，了解再生神经纤维与神经元胞体的联系以及轴浆流的恢复，方法有效。 　　2 确定神经再生的方法 　　2.1 计数标记神经元的个数 神经损伤后其再生轴索可长入支配另一器官的神经内，这种再支配通过神经逆行示踪染色的动物实验证实，即在神经损伤之前，向神经或神经所支配的肌肉内注射一种示踪剂;在神经损伤修复后一定的再生时间后，于损伤处的远侧端注射另一种示踪剂，然后通过计数面神经核内的双标(doublelabeling)神经元的数量，确定是否存在轴索错误再支配以及发生再支配轴索的比例。 　　2.2 观察标记轴索在损伤前后的变化 通过注射两种不同的示踪剂对神经轴索进行染色,观察示踪剂标记的面神经轴索在损伤前后分布的变化，直接确定神经轴索是否存在对末梢器官的错误再支配。 　　3 常用示踪剂及其特点 　　面神经示踪常用的示踪剂大体可以分为三类：辣根过氧化物酶、荧光示踪剂、生物素葡糖聚胺及其他鳌合物。 　　3.1 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP) HRP法是20世纪70～90年代发展并被广泛应用的一种神经追踪方法，即将HRP注射于神经末梢所在部位，HRP随即被神经末梢通过细胞整体胞饮的方式摄入，逆向运至胞体，然后用组织化学方法显示HRP的运输结果。HRP法的出现促进了神经示踪技术的发展，但由于HRP显影需要许多复杂的免疫组织化学技术，而且HRP参与细胞代谢，不能在细胞内长期存留，易扩散到邻近未进行染色的神经轴索或神经元中造成神经元的误染，其反应产物较不稳定,易丢失。另外还存在再摄取现象[12]，故使得HRP在神经逆行示踪方面的应用大大减少。 　　3.2 荧光素示踪剂 上世纪80 年代开始, 荧光染料作神经通路追踪的技术媒介发展起来。它贮存较稳定, 特别是组合采用不同的荧光染料分别标记神经元胞核和胞浆, 可实现荧光双标或多重标记，这是荧光素示踪的一个最大优点。这种示踪剂染色后只需使用荧光显微镜，便可观察到已被标记的神经纤维或胞体。下面介绍几种常用的荧光素。 　　3.2.1 固蓝(fast blue，FB) FB系水溶性染料,其颗粒较细密，易于被神经轴索摄取，所以标记神经纤维或胞体多于其他染料，易于从标记细胞内扩散到周围组织，照射时褪色较快，即使保存在低温、避光条件下，仍不能长期保存。对需要标记后较长时间的观察，或需分离培养神经元细胞进行实验研究则不太理想。 　　3.2.2 荧光金(fluoro gold，FG) FG系脂溶性染料,能标记细胞质，呈金黄色强荧光，而细胞核不着色，能很好显示树突分支，细胞外无荧光染料渗漏，不易扩散，与周围组织分界清晰，褪色比较慢;可以经受许多组织学染色处理，因而可以和HRP、免疫组织化学等方法结合。其在细胞质内的存在不超过3周[3]。Fluororuby(FR)及Fluoroemerald(FE)的特性与FG相似。 　　3.2.3 碳化青(1,1′Dioctadecyl3,3,3′,3′tetramethylindocarbocyanine perchlorate，DiI) DiI是一种紫红色晶体，具有高度的亲脂性,通常用乙醇溶解。它荧光强而稳定,无毒性，不影响被标记细胞的存活、生长，在标记细胞内消失慢、单纯沿脂质膜扩散，有良好的轴突特异性，且对过路纤维影响小[4]。但也存在大多数荧光追踪剂的易于淬灭及易向神经元胞体外扩散的问题。崔建礼等[5]发现注射DiI后14天，相同平面神经干内示踪