肺炎链球菌培养及荚膜多糖的提纯.pdfVIP

维普资讯 ／一 生物制品年-TI】1999—2000 51 肺炎链球菌培养及荚膜 多糖的提纯 剑 ／z， 秦 力，李 琳 ，王永胜 ，丁 轲 ，乔瑞洁，虞艳霞，陈 剐 ，、 一 (兰g,i{生物制品研 究所第三研究室 ，兰州 730046) 摘 要 ：根据流行病学资料选定 了若于血清型肺炎链球菌来制备疫苗 确定 了所使用的固体和 液体培养基 ， 及培养时蚵和培养代数 针对每一个型荚膜多糖 的特点，建立 了各 自 ：同的提 纯方法 =并对所提纯的多糖进行了生化指标和血清学检定 。结果表明提纯 的葵膜多糖除个别 血清型的个别指标外 ．其余的儿个型的指标均符合 1997年版 《欧洲药典》规定的指标 关键词 ：肺炎链球 菌；荚膜多糖 ；提纯 ． - ． _ _ 。 ． ． ． - ． · ‘ 肺炎链球菌是引起肺炎 、脑膜炎、中耳炎的重要病原菌 ，菌血症感染会引起较高 的死亡 率…。针对肺炎链球菌的感染 ，多年来一直采用抗生索治疗。但是现在耐药 菌株 多达 96％以上 ，且呈现多重耐药性状 。肺炎链球菌共有 84个型 ，其中20多个型可引起疾病 。制 备肺炎疫苗最初是纯化细菌荚膜多糖成分而制成的多糖菌苗。由于多糖是胸腺不依赖性抗 原 ，因而在 2岁以下婴儿中诱导的保护性很低 ，没有免疫记忆反应。而肺炎链球菌荚膜多糖 一 蛋 白结合疫苗，在婴幼儿中的安全 眭和免疫原性 良好，诱生的抗 PS抗体高于多糖疫苗，并 可诱导免疫 回忆反应，接种肺炎链球菌结合疫苗可以降低疫苗中血清型的携带率。 目前，美 国Wyeth—Lederle公司已研制出7价肺炎球菌结台疫苗 ，其接种对象为 2岁以下 的婴幼儿 ， 临床实验证明预防相应型链球菌肺炎感染的有效率为 l0。％ J。本课题选择在婴幼儿中最 常见的几个流行株，加上 1981年国内流行病学资料调查中显示的我 国流行的血清型 ，确定 若干个 血清型的肺炎球菌U3，分别提取其英膜多糖，与适 当的蛋白载体共价结台，制备而成 肺炎多糖蛋白结台疫苗。现将迄今为止 的研究结果报告如下。 材料与方法 1 肺炎链球菌菌种 肺炎链球菌菌种购于中国药 品生物制品检定所 2 培养基 固体培养基为含 5％羊血的普通琼脂培养基 ，液体培养基为 GYGPP培养基 ，主要成分 有蛋白胨 、酵母粉 ，氯化钠和磷酸盐等。 3 肺炎链球菌分型血清 肺炎链球菌分型血清购 白于丹麦血清研究所 。 4 肺炎链球菌菌种鉴定 肺炎链球菌种分别进行革兰氏染色镜检 、分型血清玻片凝集试验 ，葡萄糖 、麦芽糖 、乳 糖 、蔗糖 、菊糖发酵试验 、奥普托欣试验和胆汁溶解试验。 5 肺炎链球菌培养 维普资讯 52 生物制品年刊 1999—2000 启开菌种 ，接种于含 5％羊血的普通琼脂培养基上，37t 、10％O 条件下培养过夜 ，再 将此在培养基上扩增培养。然后刮取菌苔 ，接种于 200mIGYGPP液体培养基 ，37℃培养 14--l8h，同样方法进行第二代液体培养 ，然后接种于 lOL立瓶的5000ml液体培养基中， 37t摇床振荡培养，不时补充葡萄糖 ，用 7，5otol／1的NaOH调节 pH值，培养 8～lOh，OD 值 1．0时杀菌。 6 荚膜 多糖提纯 【 杀菌后的菌液离心去菌体 。加 入终浓度为 20％～30％的 乙醇，离心去核酸。取上清 液 ，加入不同终浓度的乙醇，沉淀多糖 。将沉淀溶于醋酸钠溶液 中，加入苯酚 ，离心除蛋 白， 吸取上清液。上清液透析除酚 。透析后加入终浓 度为 60％～80％的乙醇 ，取沉淀 ，用无水 乙醇和丙酮洗涤沉淀 。此即为精制多糖。 7 荚膜多糖的检测 7．1