用血红蛋白的提取与分离cr20111221.pptVIP

(一)蛋白质分离和提取的原理 一.基础知识 根据蛋白质各种特性的差异： 分子的形状、大小 电荷性质和多少 溶解度 吸附性质 对其他分子亲和力 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？ 变性、变性、空间结构 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白 （二）蛋白质提取和分离的方法 凝胶色谱法：又称分配色谱法 电泳法 1.凝胶色谱法 2）材料：凝胶 (分配色谱法) 1）概念 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法 凝胶是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道。 3.凝胶色谱法的原理—分子筛效应 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。 凝胶色谱柱 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 2.电泳 1)概念 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程 2)原理 利用了待分离样品中各分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 3)类型: 琼脂糖凝胶电泳 聚丙稀酰胺凝胶电泳 4)实例： SDS——聚丙稀酰胺凝胶电泳 用途: 测定蛋白质的分子量 鉴定蛋白质的纯度 原理： SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。使电泳迁移速率完全取决于分子的大小。 讨论：如何测定蛋白质的分子量？ 使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。 血液 血浆 水 分 其他物质： 血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等 血细 胞 白细胞 血小板 红细胞 （最多） 血红蛋白 （90％） 两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁红素基团 血液有哪些成分？ (三)缓冲溶液 抵制外界的酸或碱对溶液pH值的影响，维持pH基本不变 1.作用 2.配制 如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4 说出人体血液中缓冲液? 通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。 二.实验操作 (1)红细胞的洗涤 (2)血红蛋白的释放 (3)分离血红蛋白溶液 样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定 透析除去分子较小的杂质 通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度 二、实验操作 1.样品处理： （二）操作过程 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。 用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞 提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的 红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。 1.洗涤红细胞 洗涤过程： 血液 100mL 3g柠檬酸钠 低速离心 2 min 红细胞 血 浆 吸出血浆 红细胞 5倍体积生理盐水 搅拌10min 重复洗涤3次，直至上清液没有黄色 速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞 等一同沉淀，达不到分离的效果 1.洗涤红细胞 阅读思考：洗涤的目的是什么？ 除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化 2.释放血红蛋白 阅读思考： 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入 了哪些物质？ 2.为了加速释放过程，采取了什么措施？ 目的分析： 蒸馏水的作用是______________________________。 加入甲苯的作用是____________________________。 充分搅拌的目的是____________________________。 使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂 3.分离血红蛋白 分离过程 红细胞破 碎混合液 高速离心 10min 离心管 滤纸 过滤 脂类物质 烧杯 2000r/min的速度 (3)分离血红蛋白溶液： ①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以 2000r/min的速度离心10 min。 ②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色 透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白 色薄层固