PCR-ELISA快速检测高致病性禽流感病毒方法的建立.pdfVIP

·54· 疾病防治 中国畜牧兽医 2005年第32卷第6期 PCR—ELISA快速检测高致病性 禽流感病毒方法的建立 亢文华1，郝俊峰1，张仲秋2，宁宜宝2，赵德明1 (1．中国农业大学动物医学院，北京 100094；2．中国兽医药品监察所，北京100081) 摘要：作者针对H5亚型禽流感病毒的包含多碱性氨基酸裂解点特异性片段，设计特异性引物并从病料中扩增出RT—PCR 产物，再以ELISA方法判断PCR扩增的有无。结果表明，本方法具有较高的特异性和敏感性。 关键词：PCR；ELISA；高致病性禽流感病毒 中图分类号：$854．4+3 文献识码：A 文章编号：1671—7236(2005)06—0054-02 1．2．1 PCR 目前检测禽流感(avianinfluenza，AI)的方法有PCR扩增反应取4弘l模板加到50p1 buffer mmoldNTPs2 血凝和血凝抑制试验、病毒分离法、RT—PCR、荧光反应液中(10×PCR5弘l，2．5 PCR等。上述方法虽然可以对病原作出诊断，但存 肚l，上游和下游引物各为30 DNA聚合酶1 pmol，Taq 45S，52：C 在费时、代价高、敏感性和特异性不够理想、难于在 U)。PCR程序参数为：94℃5rain，94‘C 45S，72℃45 生产中推广的缺点。因此，建立快速、特异、敏感的针 S，共循环30次，最后72℃6min，同时 对病原的诊断方法，对于在进出境贸易中增强我国 设阳性对照、阴性对照各1份，扩增完毕后备用。 禽产品的竞争力以及AI的诊断和防制都非常重要。 1．2．2ELISA反应 取50弘lPCR产物加入生物 本研究旨在针对高致病性禽流感H5亚型病毒， 亲和素包被的微孔酶标板的微孔中，混匀后37℃放 设计特异性引物，建立RT—PCR—ELISA方法，探索置30 新的，更为快捷、简便、灵敏的病原检测方法。 S，重 1材料和方法 复3次，然后再加入50弘l抗地高辛一过氧化物酶酶联 1．1材料 物(100U／m1)于37℃放置30min，然后弃去孔中酶 1．1．1主要仪器和试剂 PCR扩增仪(Bio—Rad)； DG3002A型酶联免疫检测仪(华东电子管厂)；漂洗至少3S，然后分别加入底物显色，当阴性对照 孔略微显色，立即加终止液终止显色，酶标仪阅读 dNTPs、TaqDNA聚合酶(Promega)；生物亲和素 450 包被的微孑L酶标板、辣根过氧化物酶标记的抗地高 nm波长吸光值。 Time 1．2．3结果计算取阴性对照的PCR产物，用双 Real PCR 辛抗体(Roche公司)；7500 System (Sigapore)。 1．1．2 引物从高致病性禽流感H5亚型病毒的包 复，做为本底值，其余样品的O