SYBRGreen I荧光定量RT-PCR检测J亚群禽白血病病毒方法的建立及应用分析.pdf

摘要 J 亚群禽白血病( (Avian Leukosis Virus Subgroup J ,ALV-J)是由J 亚群禽白血 病病毒引起的鸡骨髓样细胞瘤以及其它肿瘤性性疾病。1999 年，我国首次由杜 岩等在肉鸡的商品代中分离了ALV-J 。J 亚群禽白血病在我国呈现了不断发展的 态势,宿主范围已从肉用型鸡向蛋鸡和地方鸡种蔓延,病鸡的生产性能降低，死亡 率明显升高, 给我国养禽业造成严重的经济损失。因此，建立快速、特异和敏感 的ALV-J 检测方法具有重要的实际意义。 为建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测ALV-J 的方法，本研究以ALV-J原型 毒株HPRS-103基因组中pol 基因3’端和gp85基因之间的保守区域作为检测靶基因 片段，构建其重组质粒作为阳性标准品，通过对模板浓度、引物浓度和退火温度 的优化，建立了ALV-J SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法。结果显示该方法的最低 3 检测限度为2.36×10 DNA分子/μL，较普通PCR提高100倍；可特异性扩增出545bp 的ALV-J 目的基因，而对其他禽源病毒无交叉反应；批内变异系数为0.17~2.43% ， 批间变异系数2.73~3.68% ，均小于5% 。表明所建立的方法较高的灵敏性、很强 的特异性、好的重复性和稳定性。 根据所建立的荧光定量RT-PCR方法对临床样品和市售禽类疫苗进行检测。 在所检测的12种不同禽类疫苗中均未检测到ALV-J，表明所检测的市售禽类弱毒 苗中无ALV-J污染。在所检测的4个品种125只临床疑似病鸡中ALV-J阳性检出率 为46.40% （58/125 ），其中岭南黄肉鸡、淮南麻黄鸡、地方鸡种和京红1号蛋鸡 的阳性检出率分别为65.31% （32/49 ）、55.26% （21/38 ）、31.25% （5/16 ）和0% （0/22 ），表明不同品种的鸡对ALV-J 的易感性不同。 选择10只27周龄阳性感染期岭南黄肉鸡，应用荧光定量RT-PCR方法检测不 同脏器中ALV-J 的分布及其mRNA表达水平。结果发现在心脏、肝脏、脾脏、肺 脏和肾脏中均能检测到病毒基因，多重比较检验分析显示肾脏中ALV-J 基因 mRNA表达水平显著高于其他脏器，而肺脏、心脏、肝脏和脾脏之间无明显差异。 这为进一步研究机体与病毒之间的相互作用，以及致病机理的探明奠定了基础。 综上所述，本试验建立的荧光定量RT-PCR方法是一种特异、快速（6h左右） 和较灵敏的检测方法，可用于快速诊断临床样品、净化鸡场效果检测以及在不同 脏器中病毒的表达水平的研究。 关键词： J亚群禽白血病病毒，荧光定量PCR，定量检测，应用 I Abstract Subgroup J Avian Leukosis referred to chicken myeloid cell tumor and other tumor diseases caused by Avian Leukosis Virus subgroup J (ALV-J). ALV-J was isolated from commercial broilers for the first time in 1999 in China. ALV-J has spread widely over China since 2000, and its host range extended from meat-type chickens to laying hens and local chicken breeds. Production ability of infected chickens was decreased and the morality was quickly increasing, which had brought great losses for domestic poultry industry. Therefore, t