低氧反应元件调控缺血心肌转染hVEGF165基因表达对新 生血管影响.docVIP

低氧反应元件调控缺血心肌转染hVEGF165基因表达对新 生血管的影响 　　作者：董红燕,王强,张中明,袁延亮,张宜乾,徐　　作者单位：1.徐州医学院神经生物学研究中心，江苏徐州221002; 2.徐州医学院附属医院胸心外科，江苏徐州221002 　　国家自然科学基金 　　【摘要】 目的 探讨动物整体水平下低氧反应元件(HRE)调控缺血心肌转染hVEGF165基因表达对促生血管的影响。方法 建立兔心肌缺血动物模型，实验分为转基因组、缺血对照组、载体对照组和假手术组。取缺血区心肌组织，检测心肌组织HIF-1Α和hVEGF165表达，应用CD31及Α-SMA免疫组化染色测定缺血心肌新生血管密度变化。结果 心肌缺血早期，伴随内源性HIF-1Α表达增加，hVEGF165 mRNA及蛋白表达相继升高，缺血4～6周至高峰(P0.01)，缺血12周，hVEGF165表达下调至缺血前水平。缺血12周，转基因组CD31(+)血管密度显著高于缺血对照组(P0.01);但是，与缺血前相比，缺血12周， 转基因组Α-SMA(+)血管密度显著低于缺血前水平(P0.01)。结论 HIF-1Α-HRE对缺血心肌转染hVEGF165表达发挥了有效的正相调控作用，有效地促进缺血心肌毛细血管生成。但hVEGF165作为促血管生成早期调节因子，其促生血管的结构尚不完整。 　　【关键词】 低氧反应元件;血管内皮生长因子;基因调控;心肌细胞;缺氧 　　本课题组前期研究结果表明，在细胞水平，低氧反应元件(HRE)对缺血心肌转染hVEGF165 基因表达发挥了良好的调控作用[1-2]。但是，在动物整体水平，HRE对缺血心肌转染hVEGF165基因长期调控行为对促血管再生的影响尚未阐明，本研究旨在动物整体水平，探讨在HRE调控下，缺血心肌转染hVEGF165基因表达对再生血管生成的影响，为提高缺血心脏hVEGF165 基因治疗的有效性及安全性提供实验依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 病毒包装及纯化 　　pAAV-9H-hVEGF165由美国加利福尼亚大学Prof. Su惠赠。pAAV-Helper、pAAV-RC由北京协和医院提供。病毒包装由本课题组前期工作完成[1]。将HEK293T细胞接种于9 cm平板，10 Μg pAAV-9H-hVEGF165、10 Μg pAAV-RC、15 Μg pAAV-Helper、2.5 mol/L CaCl2 100 Μl与去离子水混合至500 Μl，加入500 Μl 2HeBS，混匀后加入HEK293T细胞培养皿中，培养2～3天，将细胞从培养皿上刮下、离心，加入80 mmol /L MgCl2的PBS至细胞密度为107个/ml，加入DNA酶Ⅰ和RNA酶,离心，取上清加入粉剂PEG8000至终浓度10%;冰上置1 h，离心，25 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶解沉淀。采用等体积氯仿抽提，离心，回收水相，-20℃保存、备用。 　　1.2 实验动物 　　成年新西兰大耳白兔，雌雄不限，体重2～2.5 kg，平均(2.3 ± 0.15)kg，共147只。由徐州医学院实验动物中心提供。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1 心肌缺血动物模型制备 　　动物硫贲妥钠静脉麻醉，正中开胸，显露心脏。在左冠状动脉前降支上1/3交界处，6-0无损伤线缝扎，肉眼见结扎点下方左室前壁心肌渐变青紫、肿胀，同期监测ECG出现典型心肌缺血改变者，确认模型成功。 　　1.3.2 实验动物分组及处理 　　实验动物随机分为4组。转基因组(A组，n=42)：模型动物，心脏缺血区域分4点注射40 Μl rAAV-9HRE-hVEGF165。缺血对照组(B组，n=42)：模型动物，心脏缺血区分4点注射40 Μl 0.01 mmol/L PBS。载体对照组(C组，n=42)：模型动物，心脏缺血区分4点注射40 Μl 9HRE-LacZ。假手术组(D组，n=21)：正常动物，仅开胸，游离左冠状动脉，未结扎。 　　4组动物分别于缺血前(0)及术后2、4、6、8、10、12周取材(A、B、C组每时间点6只，D组3只)。 麻醉后取动物心脏，取材组织分别采用液氮保存(Real time-RT-PCR及Western-blot检测)及10%中性甲醛固定(免疫组化)。于缺血12周时点，另取A和B组肝脏组织，液氮保存，待Western-blot检测。 　　1.3.3 心肌低氧诱导因子(HIF-1Α)及hVEGF165mRNA表达检测 　　采用Real-time RT-PCR方法定量检测心肌组织HIF-1Α及hVEGF16