凡纳对虾PEN-2的表达纯化与抗体制备.pdfVIP

第41卷第3期 河南师范大学学报(自然科学版) ％Z．41No．3 HenanNormal ScienceEdition) Mav．2013 2013年5月 Journalof University(Natural 文章编号：1000—2367(2013)03—0127—03 凡纳对虾PEN一2的表达纯化与抗体制备 杜志强，吴亚坤 (内蒙古科技大学数理与生物工程学院；生物工程与技术研究所，内蒙古包头014010) 摘 要：对虾素分子在甲壳类动物体液免疫系统中发挥着重要的免疫防御与清除作用，它是一种重要的抗菌 肽分子．以1种新发现的凡纳对虾PEN-2对虾素基因作为研究对象，进行了重组表达载体的构建、蛋白诱导表达与 纯化以及多克隆抗体的制备等研究工作，这些研究结果为下一步I．v-PEN-2分子功能研究提供重要基础． 关键词：凡纳对虾；对虾素分子；诱导表达；纯化；抗体制备 中图分类号：Q786 文献标志码：A 对虾素分子是甲壳类动物先天免疫系统中重要的免疫效应分子，它在宿主针对细菌侵染涉及到的体液 免疫过程中发挥着重要的防御与清除病原的作用口3．本文以凡纳对虾的对虾素PEN一2基因作为研究对象， 通过大肠杆菌重组表达系统进行了诱导表达之后，对目的蛋白进行了亲和纯化；而且，制备了多克隆抗体，这 些研究结果为今后针对Lv-PEN一2分子功能的研究奠定了基础． 1材料与方法 1．1实验菌株 克隆菌株：实验室低温保存的大肠杆菌DH5a．表达菌株：实验室低温保存的大肠杆菌BL21(DE3)． 1．2方法 1．2．1 目的基因的克隆利用实验前期进行凡纳对虾PEN-2基因序列克隆过程反转录得到的各组织cD— tca aacatc tca NA作为模板，以Lv-PEN一2特异的表达引物F(5。tac g塑!!￡atggtg aaggca一3、)和R(5、。tac ttatcc ttttactaa !!!g垒g gtg一3、)作为PCR实验的引物，进行目的基因表达片段的扩增． I和Xho 化，并且与经过EcoR I双酶切、回收纯化后的质粒载体pET一28a(+)进行T4DNA连接酶过夜连 接，反应温度为16℃．次日，将连接产物进行“热激法”转化大肠杆菌DH5a；筛选阳性克隆子后，提取重组质 粒，并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞[2]． 1．2．3诱导表达与亲和纯化 mmol· 过夜扩大培养．次Et，重新转接到新鲜的液体LB培养基中进行转培养4h；转培养结束之后，按照1 L叫的终浓度要求加入IPTG，进行诱导表达3h，最后进行SDS实验来检测重组蛋白质的表达情 1／lO，2／10，3／lO，4／10，并且进行、SDS实验来检测重组蛋白质的纯化情况[41 1．2．4多克隆抗体的制备以纯化得到的Lv-PEN一2重组蛋白作为抗原，以长耳白兔作为实验动物，进行 多克隆抗体的制备．每隔1周按照皮下多点注射的要求，至少将200g重组蛋白与佐剂充分混合后注射家 兔，至少注射4次¨J． 1．2．5抗体质量的检测第4次注射蛋白质抗原之后7～10d，从家兔的耳缘静脉抽取少量血液，低速离心 收稿日期：2013一Ol—lO 基金项目：内蒙古自治区自然科学基金(2011BS0502) 作者简介：杜志强(1980一)，男，山西大同人，内蒙古科技大学副教授，研究方向：无脊椎动物先天免疫基因工程研究 万方数据 128 河南师范大学学报(自然科学版) 后分离血清，之后利用Western blotting实验检测抗体的滴度，来判断是否