老鼠实验方案.docVIP

槲皮素肺、心含量的测定 1. 药动物学试验 实验鼠（150g~200g，265±？？g表达准确些）给药前禁食12h，自由饮水。用0.5%的羧甲基纤维素钠溶液分别将橙皮素和甘草次酸制成悬浮液，高浓度（溶液组成：槲皮素+0.5%羧甲基纤维素钠）灌胃给药（橙皮素）20mg.kg-1，低浓度（溶液组成：槲皮素+0.5%羧甲基纤维素钠+甘草次酸）灌胃给药槲皮素)10mg.kg-1。空白对照组实验鼠灌胃0.5%羧甲基纤维素钠。 将实验鼠按三雄三雌随机分组，每组共6只。按要求给药，根据分布相、平衡相、消除相分别在给药后1.5小时、3小时、4小时、空白组为灌药后1小时宰杀实验鼠，迅速取出肺、心组织，用生理盐水冲洗，置于冻存管中（放置分别是1雌、1雄、2雌、2雄共4支离心管），于冰箱中冷冻保存。 2.溶液的配制 槲皮素储备液：精密称取橙皮素25mg，置于50ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得500ug.ml-1的橙皮素贮备液，使用时用甲醇稀释至所需浓度。 橙皮素内标液：配制橙皮素浓度为0.2mg.ml-1溶液50ml，即0.2 mg.ml-1*50ml=10mg，槲皮素百分含量97%，则将M槲皮素=10mg/97%=0.0103g溶解于甲醇中配制成浓度为0.2mg.ml-1的橙皮素内标液. 3. 组织样品的处理 从冰箱中取出肺、心组织样，解冻，将组织先剪成几大片，剔除组织周围其他杂质成分如血块等，再剪碎，滤纸吸干。 ▲分别称取组织0.2g，按2.5ml.g-1组织加入生理盐水（0.5ml）、20ul内标液（橙皮素浓度为0.5mg.ml-1）制成组织匀浆液。在组织匀浆液中再加入甲醇600ul，涡旋60s，3500（可以转数更高，建议最好10000，以节约时间，和充分沉淀）转每分钟，离心15min，定量吸取上清液800ul（尽可能吸多，但所有过程要求取出体积一致），50摄氏度氮气流下吹干（即已预处理过的组织干样）冰箱冷藏备用。 ●测定时将上述干品用HLPC流动相（100ul，用甲醇）再次溶解，涡旋60s（或用移液枪混合均匀），10000转/分钟离心3-5min，取上清液20ul进样。 3. 测定方法、条件 (1)色谱条件(该条件要试验，保证内标与待测物峰充分分离，峰形好) CTO-20A色谱仪，流动相流动相：甲醇：磷酸（45:55）；检测波长373nm；流速1.0ml.min-1；柱温35摄氏度；进样量20ul。 （2）方法专属性（看色谱图有没有干扰测试情况） 空白(灌服0.5%羧甲基纤维素钠)实验鼠组织样液； 空白(灌服0.5%羧甲基纤维素钠)实验鼠组织样液+对照品（槲皮素浓度1ug.ml-1）； 灌服低浓度药液实验鼠组织样液； 灌服高浓度药液实验鼠组织样液； （分别测定上述空白、对照、低浓度、高浓度组实验鼠体内肺、心组织槲皮素含量。在后面再测定） (3)标准曲线 取大鼠空白组织（质量与含药组织相同），分别加入橙皮素浓度为0.05，0.10，0.50，1.00，5.00，12.50，25.0ug.mL-1（此浓度适合样品测定）系列浓度工作溶液各100ul，得到系列含药组织（ug药/g组织），然后加入等量内标，按照上述3第二（即▲）、第三段（即●）处理，进样，以槲皮素峰面积A/内标峰面积为纵坐标，浓度C（ug药/g组织）为横坐标，进行线性回归，求线性回归方程。 （4）精密度实验和准确度 取大鼠空白组织（质量与含药组织相同），分别加入浓度为1.0，5.0，12.0ul.mL-1的槲皮素溶液100ul制成低、中、高3种浓度的含药组织（ug药/g组织，标称值），然后加入等量内标，每个浓度平行5份，按照上述3第二（即▲）、三段（即●）处理，进样20ul，于1d内测定5次。求低、中、高3个浓度组织样的日内RSD值。日间精密度的测定以同样的方法进行，每天测定1次（份），连续测定5d（其中一份应用日内数值），求低、中、高3个浓度组织样液的日间RSD值。 由测定的槲皮素峰面积A/内标峰面积比，从标准曲线可以计算得到三个浓度测定值C2，准确度表示为测定值/，标称值（一般100±5%为宜） （5）稳定性试验 取大鼠空白组织（质量与含药组织相同），分别加入浓度为1.0，5.0，12.0ul.mL-1的橙皮素溶液100ul制成低、中、高3种浓度的含药组织，各三份，按照上述3第二匀浆后，在-20摄氏度条件下存放5d，每次测定时，将三份全部拿出解冻，解冻后，将其中一份按照上述3第二、三段处理提取；另两份放回冰柜在-20摄氏度冷冻，全冻后，将剩下两份全部拿出解冻，解冻后，将其中一份按照上述3第二、三段处理提取；另一份放回冰柜在-20摄氏度冷冻，全冻