RNA提取电泳注意事项.doc

实验十一 动物组织细胞总RNA的提取 一、实验原理 RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。获得高纯度和完整的RNA 是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。因此提取必须在无RNase的环境中进行。可使用RNase抑制剂，如DEPC是RNase的强抑制剂，常用来抑制外源RNase活性。提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制RNase活性。并有助于除去非核酸成分。 本实验介绍异硫氰酸胍法和TRIzol法提取动物组织总RNA并通过电泳 进行鉴定。 二、仪器和试剂 1.仪器： 超净工作台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、振荡器、移液器、吸头、Ep管、玻璃匀浆器、试管、 玻璃器皿洗净后置180℃烘烤8h；不耐高温的器皿（如塑料制品）应用0.1% DEPC浸泡2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高压20min，再70～80℃烘烤干燥方可使用。 2.试剂： (1)细胞裂解液： 异硫氰酸胍 4mol/L 柠檬酸钠（pH7.0） 25mmol/L 十二烷基肌氨酸钠 0.5% β-巯基乙醇 0.1mol/L 称取柠檬酸钠0.64g，十二烷基肌氨酸钠0.415g，吸取β-巯基乙醇0.7ml，用无Rnase的蒸馏水溶解，定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，异硫氰酸胍 25g,混合，完全溶解后4℃保存备用。 (2)10×凝胶缓冲液： 吗啉代丙璜酸（MOPS）（pH7.0） 200mmol/L NaAc 100mmol/L EDTA(pH 8.0) 10mmol/L 过滤除菌后避光保存。 （3）5×变性上样缓冲液： 水饱和的溴酚蓝 16μl 500mmol/LEDTA(pH 8.0) 80μl 甲醛（37%） 720μl 甘油 2ml 甲酰胺 3084μl 10×凝胶缓冲液 4ml 加无RNase水至10ml，4℃可保存3个月。 （4）TRIzol RNA抽提试剂 （5）2mol醋酸钠 （6）0.1% DEPC (7)平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） （8）平衡酚、氯仿 （9）无水乙醇、70%乙醇、异丙醇 (10)无RNase水 三、操作步骤 （一）异硫氰酸胍法（PLT） 1.取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的细胞裂解液1ml,在冰浴中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一试管中。 2.加入2mol醋酸钠（pH4.0）120μl，充分混匀。 3.加入1.2ml酚：氯仿：异戊醇，充分混匀摇振10s，冰浴15min。 4.将混合物转移至1.5ml Ep管中，4℃，离心10 000r/min,20min. 5.移取上层水相至另一Ep管中，加入等体积的异丙醇，静置?C20℃，30min沉淀RNA. 6. 4℃，离心12 000r/min，15min. 7. 弃上清液，加入70%乙醇400μl,洗涤RNA沉淀物；如果RNA沉淀物被悬浮，则4℃离心10 000r/min，10min。 8. 弃上清液，自然干燥，但应避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。 9.加入100μl无RNase水重悬RNA，或加1ml无水乙醇和1/10体积3mol醋酸钠（pH4.0），?C70℃保存。 （二）TRIzol试剂提取RNA 1.取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的Trizol液 1ml 于玻璃匀浆器中，在冰浴中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一1.5ml Ep管中，于室温下静置5min。 2.加入200μl氯仿，剧烈振摇15s混匀后，室温静置3min。 3. 4℃，10 000r/min离心15min，RNA分布于水相中。 4.将上层无色水相转移到另一Ep管中，加入500μl 异丙醇，室温静置10min。 5.4℃，10 000r/min离心10min。 6.弃上清液，用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀物，4℃，7500r/min离心5min。 7.弃上清液，室温干燥15min. 8.向干燥过的沉淀物中加入200μl DEPC处理水（无核水）溶解沉淀物，于-20℃保存备用。 （三）RNA检测 1.在紫外分光光度计上检测RNA浓度及纯度。 方法同实验四，用DEPC处理水