激光共聚焦显微镜样品制备方法(一)——细胞培养样品.pdfVIP

第29卷 第 2期 电 子 显 微 学 报 Vol一29．No．2 2010年 4月 JournalofChineseElectronM icroscopySociety 2O10—04 文章编号 ：1000—6281(2010)02—0185—04 激光共聚焦显微镜样品制备方法 (一) — — 细胞培养样品 余礼厚 (中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研 究所 ，上海 200031) 摘 要：随着激光共聚焦显微镜在生物学研究中的广泛应用，绿色荧光融合蛋 白能够提供蛋 白质在细胞体 内的精 确时空信息。因此免疫荧光样品的制备也成为基本的细胞生物学实验方法。本文主要介绍在培养细胞 中表达绿 色荧光融合蛋 白及免疫 荧光样品的制备过程。 关键词 ：绿色荧光蛋 白；细胞培养 ；免疫荧光 ；激光共聚焦显微镜 中图分类号 ：Q336 文献标识码 ：A 随着生物学研究的不断深入 ，越来越多的研究 考 《分子克隆实验指南 (第三版)》 。在设计荧光 要求在细胞体 内(invivo)，甚至是动物体水平上研 融合蛋 白前 ，研究者应考虑荧光融合蛋白的用途 ，使 究蛋 白质功能或动态变化。而随着检测设备 的提 用何种荧光蛋 白，及荧光蛋 白插入 的位置 (N端 、C 升 、各种显微技术的发展和标记手段的提高 ，使得研 端或定位信号序列之后)。 究者能够迅速 、准确地观察到蛋白质在细胞内的表 2 荧光表达载体的导入 达情况和定位。通过激光共聚焦显微镜观察荧光标 记细胞内的蛋白质和分子 ，为生物学的研究提供了 将构建好的荧光表达载体进行大量扩增 ，并通 更直观的观测手段。因此免疫荧光样品的制备也成 过质粒抽提试剂盒大量纯化 ，得到不含有内毒素的 为生物学研究中的基本技术方法 。鉴于生物体内的 纯化质粒 。将表达载体导入到培养细胞 中后，经过 复杂多样性 ，制备免疫荧光样品的方法也存在一些 培养即可进行荧光蛋 白的检测。而将基 因导人哺乳 差异。本文主要介绍构建绿色荧光融合蛋白表达载 动物培养细胞的方法有很多种 ，生化转染法是很常 体，并在培养细胞 中表达绿色荧光融合蛋 白及免疫 用的导人培养细胞方法。常用的转染方法有：磷酸 荧光样品的制备过程。 钙转染法和脂质体介导的转染法。这些方法都是通 过 DNA与化学试剂 (磷酸钙或脂质体)形成复合 l 绿色荧光融合蛋 白表达载体的构建 物，促进 DNA进入细胞 。依据不 同的细胞类型 ，采 绿色荧光蛋 白(greenfluorescentprotein，GFP) 用不同的转染策略。磷酸钙转染法参考 《分子克隆 及其突变体能在各种不同的生物系统中表达 ，这对 实验指南 (第三版)》-z，而脂质体介导的转染法参 细胞生物学的研 究具有重要意义 。而荧光蛋 白 考所使用脂质体的使用手册。 的折叠能力及其同细胞内蛋白的融合能力 ，使研究 2．1 玻璃片的处理 者能直接在细胞体内观察到蛋 白质的特性 。研究者 为了方便在激光共聚焦显微镜上观察 ，免疫荧 不需要把蛋白质经过纯化、标记并再转移到细胞体 光样品通常需要制备在载玻片上。培养的细胞需要 内的过程 ，可直接在细胞水平 ，甚至是整个动物体水 在盖玻片上贴壁生长。盖玻片的厚度应小于 0．17 平上观察