DNA结合蛋白的磷酸化研究.pdfVIP

中国试剂网 3.9.16 DNA 结合蛋白的磷酸化研究 磷酸化化学计量的确定及磷蛋白形成动力学的测定  磷酸化作用化学计量的确定 1．在冰上建立下列反应混合液： Tris-HCl （50mmol/L；pH8.0 ）/MgCl2 （10mmol/L） 250 μl ATP （10mmol/L） 1 μl 纯化的DNA 结合蛋白 （1mg/ml） 4 μl [ γ-32P]ATP （13 μCi ） 1.3 μl 2 ．将反应液混合物分成125 μl 的两个部分，记为A 部分和B 部分。B 部分将被 用于动力学实验。 3 ．在6 个干净管中各加入20 μl A 部分溶液，然后各管中依次加入0，0.5，1， 2 ，3 和4 微单位的蛋白激酶以开始磷酸化测试。室温下反应30 分钟。 4 ．将10 μl 每一磷酸化测试混合液点在一张2cm ×2cm 的Whatman 3MM 滤纸 上，将该滤纸在10％TCA/1%焦磷酸钠溶液中洗10 分钟（每张滤纸用5ml 溶液）。 更换溶液重复洗两次。用100％乙醇洗滤纸。通过对每张滤纸所发出放射性的计 数来确定每个样品中磷蛋白的掺入量。 5 ．在每个管中加入1.1 μl 100 ％TCA 以沉淀管中剩余的10 μl 磷酸化测试混合液。 在冰上放置20 分钟，室温下用微型离心机在10 000r/min 离心10 分钟以收集蛋 白质沉淀。先用90 ％后用100％丙酮洗沉淀。在空气中干燥沉淀5 分钟。 6 ．将样品加到SDS－聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中，在160V 下1×电泳缓冲液（10 ×贮液配制）中电泳40 分钟。用Saran®膜包裹湿胶，对X 光片曝光3 小时左右。 7 ．以放射自显影胶片为模板，切下与 DNA 结合蛋白相对应的被标记的条带。 用5 倍体积30 ％过氧化氢在37℃处理凝胶条带6～12 小时以溶解DNA 结合蛋 白。通过对每个样品的契仑科夫放射的计数来确定磷蛋白的掺入量。 8．用以下两种方法测定待测液中的总掺入量： a ． 将9 μl 分析缓冲液（50mmol/L Tris-HCl pH8.0/10mmol/L MgCl2 ）加到1 μl A 部分溶液中，将混合液点在一张2cm ×2cm 的Whatman 3MM 滤纸上。不要用 TCA 处理滤纸。对滤纸所发出的放射性进行计数。 b ．将1 μl A 部分溶液加到适当体积的30 ％过氧化氢溶液中，并对契仑科夫放射 中国试剂网 3.9.16 性进行计数。 9 ．计算掺入到蛋白质中的磷酸的莫尔数。在本实验中，每个分析包含800 pmol ATP 和8 pmol （0.3 μg ）蛋白 （如果待测DNA 结合蛋白是GBF1 的话，其分子 量为37 000 ）。1％掺入蛋白中的放射性相当于每莫尔蛋白含有1 摩尔磷酸。 [NextPage]  磷蛋白形成动力学的测定 1．向B 部分中加入 18 微单位蛋白激酶并在室温下放置。在第0，5，10，20 ， 25 和30 分钟时各取20 μl 试样。取出后立即终止磷酸化反应，取其中10 μl 点 在一张2cm ×2cm 的Whatman 3MM 滤纸上，并用TCA 处理，剩余10 μl 用1